胚胎植入前遗传学诊断技术

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1、胚胎植入前遗传学诊断技术屮华妇产科朵志2(X)0年第8期第35卷综述作者：陈瑛张玉兰胡桂英单位：陈瑛(150086哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科)；张玉兰(150086哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科)；胡桂英(150086哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科)植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)技术，是指通过体外受精获得的胚胎在送入母体宫腔前取1个或儿个胚胎细胞进行遗传学分析。据估计，人群中约有1/4到1/5的人患某种遗传病，平均每人携带5〜6个致病棊

2、因［1］。这将对未来的人类造成巨大的遗传负荷(geneticload)。因此PGD技术的产生与完善使试管婴儿技术不再局限于治疗不孕症，它在阻断遗传病传播、降低人类遗传负荷上都具重要意义。根据遗传物质发牛变化的方式不同，可将PGD技术归为4类：染色体分析、DNA分析、RNA分析和蛋白质分析。以下対这4类技术分别综述如下。一、染色体分析染色体数目或结构发生变化，可能导致某种综合征。由于促排卵药物的应川以及体外环境因素的影响，体外受粘获得的胚胎染色体异常率很高，一些胚胎发育阻滞也与染色体异常有关。植入询对染色体

3、进行分析，一方而，为高质量胚胎的筛选提供依据，以利于提高植入率；另一方而，可以避免性染色体异常以及三体患儿岀生。染色体分析普遍采用荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)。将DNA探针用不同颜色的荧光染料标记，与固定在玻片上的卵裂球细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光。从而对染色体异常进行筛查［2］。FISH简要流程为：(1)固定卵裂球细胞于玻片上；(2)细胞裂解；(3)脱水(4)荧光标记探针，并使Z与卵裂球染色体杂交；(5)漂

4、洗除去背呆染料；(6)加入二氨棊苯基II引喙(4‘,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)负染(counterstain),在荧光显微镜下观察。一般每个卵裂球细胞只能标记5条染色体，约需5个多小时。而Liu等［3］釆用3次FISH对一个玻片上的细胞多次杂交，可以分析6条以上染色体，总共只需6h。无论是中期核述是减数分裂后期核，都对以用该法，简单方便，对检测到细胞是否丢失，是植入前胚胎筛查的常规手段。它主要用于染色体数目异常以及一些微小的染色体易位的检测。如检查胚胎有无Y染色体片段

5、在X或其他染色体上易位，避免性反转现象发生。国外主张对35岁以上以及3次体外受秸失败的患者在植入前行FISH检查［4］。二、DNA分析迄今有1000多种遗传病的基

6、大］被定位，随着人类基因组计划(humangenomeprogram,HGP)工作的进展，人类所携带的10万对基因密码将被破译，为PGD提供直接可靠的依据。从原理上讲，只要己知某种致病基因，通过合适的引物可将其由单拷贝放人而检测出来。聚合酶链反应(PCR)lI成功地用丁•杜兴肌营养不良(Duchenne'smusculardystrophy,D

7、MD)［5］、脆性X舱体［6,7］、新牛儿溶血［8］、B•地中海贫血［9］、囊性纤维病(cysticfibrosis)L10］等遗传性疾病的PGDo另外，其他疾病如黑性口痴(Tay-Sachsdisease)、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,MPS)、韦■霍二氏脊髄性肌萎缩(Weniing・Hoffmandisease)等疾病也可用分子生物学的方法检测。进行PGD时，以单细胞为反应模板，PCR的功效受到限制，因此采用多种改进的PCR法。I.引物延伸预扩增(primerextens

8、ionpreamplification,PEP)：采用多个随机引物将植入前胚胎的单个细胞的整个基因组全部扩增，使目的基因成为多拷贝，再针对该目的基因进行二次扩增。其可靠性和灵敏度均令提高，主要川于单基因遗传病的诊断。Veyver等［8］采丿IJPEP法对Rh新生儿溶血病Rh(D)基因进行研究，并应川于PGD,预防新生儿溶血病的发生。2.原位PCR：为PCR扩增技术与原位杂交技术的结合。先将卵裂球细胞固定在玻片上,在原位上对廿的基因进行PCR扩增，然后通过原位杂交法检测。基本过程为：(1)将卵裂球细胞固定在

9、玻片上；(2)采用蛋白酶、胰酶等消化细胞膜；(3)盖上盖片封口后，置专门的玻片式PCR仪上进行扩增；(4)口J在扩增后与标记探针杂交检测，也可在PCR反应过程中掺入地高辛、生物素或荧光索标记的dUTP,直接检测PCR产物。该方法用于测定低单拷贝的DNA序列，可定性、定量、定位，快速、灵每攵、准确，被认为是FISH的潜在替代者。3・免疫PCR：是PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法的融合技术，利用了PCR的人量扩增能力和抗