端粒酶逆转录酶启动子htert-u6嵌合启动子的sirna 表达载体的肿瘤靶向性分析

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1、端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析作者：姜习新，张鹏辉，涂植光，杨毅，刘靳波【摘要】目的：体外研究siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性.方法：常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC7721细胞株（EGFP7721）和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF（EGFPHELF）.以PTZU6+1质粒转染EGFP7721细胞和EGFPHELF细胞为空白质粒组，siRNAEGFPPTZU6+1质粒转染EGFP7721细胞和EGFPHE

2、LF细胞为实验对照组，将siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1质粒转染EGFP7721细胞和EGFPHELF细胞作为实验组，用realtimeSYBRGreenPCR和:TostudythetumortargetingpotentialofsiRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1expressionvectorinvitro.METHODS：HepatocellularcarcinomacellSMMC7721andhumannormalfibrocytesHELF,bothexpressingfluoresc

3、enceprotEin(EGFP7721,EGFPHELF)stablyidPTZU6+1,siRNAEGFPPTZU6+1andsiRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1ployedrespectivelyastheemptyvectorgroups,experimentalcontrolgroupsandexperimentalgroups.RealtimeSYBRgreenPCRandMC7721和hTERT阴性的人正常成纤维细胞株HELF，以探讨siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1质粒在肿瘤细胞中靶向

4、性和有效性.　　1材料和方法　　1.1材料GFP抗体购自中山公司，SYBR○REXSCRIPTTMRTPCR和PrimeScriptTMRTreagentKit，rTaq酶、RNA提取试剂盒和PMD18T载体均购自TaKaRa公司.针对绿色荧光蛋白基因(EGFP)的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体(siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1)和针对绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA表达载体(siRNAEGFPPTZU6+1)为本课题组以前构建,其中siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1重组质粒根据

5、hTERT核心启动子插入U6启动子方向不同，有正向和反向重组质粒之分.引物由上海生物有限公司合成.LightgenHRPkit购自维奥基因发展有限公司.稳定表达EGFP的肝癌细胞株SMMC7721为本课题组以前构建.人正常成纤维细胞株HELF购自南京凯基生物有限公司.Lipofectamine质粒转染试剂购自Invitroge公司.人正常成纤维细胞株HELF购自南京凯基生物技术有限公司.化学发光成像仪ABI7000（维奥基因发展有限公司，宁波）.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养稳定表达EGFP的7721细胞和人正常成纤维细胞HELF培养于含有1

6、00mL/L小牛血清的DMEM培养基内，在50mL/LCO2，37℃条件下，培养2～3d后，用2.5g/L胰酶消化，传代1次.　　1.2.2构建稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF6孔板上的HELF长满到7/10时，240μL血清DMEM中加入4μgEGFP质粒.将250μL的DNA脂质体混合物加入用无血清DMEM清洗3遍的6孔板中，加无DMEM至2mL.50mL/LCO2，37℃培养4～5h后，换成有血清的DMEM继续培养.筛选24h后观察荧光，G418（800mg/L）筛选15d.单克隆细胞株的构建:将筛选后转染EGFP的HELF细胞

7、用胰酶消化后离心、计数，稀释成5000个/L，96孔板每孔加入200μL,50mL/LCO2，37℃条件下培养.　　1.2.3转染将稳定表达EGFP的单克隆细胞株SMMC7721和HELF传至6孔板，按1×108个/L的密度分别传3孔.将PTZU6+1质粒分别转染稳定表达EGFP的7721和HELF为空白质粒组,将siRNAEGFPPTZU6+1质粒分别转染稳定表达EGFP的7721和HELF作为实验对照组，将siRNAEGFPhTERT/U6PTZU6+1质粒分别转染稳定表达EGFP的7721和HELF作为实验组，质粒(4μg)与脂质体

8、(16μL)比例为1∶4，24h后用荧光显微镜观察荧光.待每孔长满后传至另外两块6孔板上的两孔中，继续培养至