花粉种子表达融合启动子合成及其表达载体构建

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1、西南大学硕士学位论文花粉/种子表达融合启动子合成及其表达载体构建姓名：魏晓峰申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：张兴国20100501摘要花粉屏中子表达融合启动子合成及其表达载体构建蔬菜学专业硕士研究生魏晓峰指导教师张兴国(研究员)摘要转基因植物的生物安全性自植物基因工程诞生之日起，就一直受到人们的关注。其中，转基因植物的环境安全性，是其得到田间释放和应用推广的审批前提条件之一。理想的环境安全性转基因植物，是对环境友好、不将携带的转基因成分扩散给非转基因植物。花粉和种子均不育或花粉和种子均在形成阶段失去所有母体中存在的转基因成分，将是创制理想的

2、环境安全性转基因植物的可能途径。迄今，通过基因工程手段，既可以使花粉或种子不育，也可是使转基因在花粉和种子发育阶段定期被删除，而且该技术在无性繁殖植物的转基因利用上几乎没用问题，但在有性繁殖植物的转基因利用(尤其是Fl组合)上却增加了制种和应用的难度，成为国内外学者竞相研究的难题。要解决这一难题的重要途径之一是拥有严紧、高效、特异表达的花粉／种子启动子，而且该启动子能够被诱导关闭，以便得到可育的花粉和种子或者得到转基因未被删除的花粉和种子，从而使转基因得到纯合、转基因纯合材料得到繁殖。本实验室己建立了一个四环素负调控系统，但缺乏花粉／种子特异表达启

3、动子，因此，本实验从番茄基因组中扩增出了花粉特异表达启动子LAT52，与种子特异启动子的控制元件相拼接，合成了人工花粉／种子特异表达融合启动子，并和GUS报告基冈拼接，构建成双元表达载体；经农杆菌介导将双元表达载体分别转入烟草与拟南芥中，以期分析和验证该花粉，种子启动子表达的严紧性、高效性和特异性。主要实验结果如下：1．克隆了番茄花粉特异表达启动子LAT52以番茄为模版，采用半巢式PCR扩增方法，得到618bp的目的条带。克隆进含有种子特异启动子的pMDl8一T载体后，获得重组质粒pMD．LAT52。序列测定后，与GenBank公布的序列(X158

4、55)进行比对，相似度为98％，仅在非关键区多出7个碱基，在多A串联区的中少一个A；其中，多出的7个碱基AAAAAAT是一个简单序列重复(simplesequencerepeat，SSR)，在该变异位点有4个重复，比GenBank登记的序列增加了一个。2．构建了带有种子，花粉表达融合启动子LAT52Sd和GUS报告基因的双元表达载体将豌豆种子特异表达基因启动子的重要控制元件与番茄花粉特异表达启动子LAT52相两南大学硕十学位论文拼接，构成种子／花粉表达融合启动子LAT52Sd，并构建了带有LAT52Sd．GUS表达盒的双元表达载体。3．LAT52S

5、d．GUS基因导入烟草和拟南芥采用叶盘法经农杆菌介导在150mg／L卡那霉素的筛选压下筛选，得到卡那霉素抗性烟草植株。在50mg／L卡那霉素的筛选压下筛选经农杆菌介导的整植株侵染方法获得的种子，得到卡那霉素抗性拟南芥植株。关键词：花粉／种子表达启动子LAT52Sd：双元表达载体；烟草；拟南芥UABSTRAC下曼／———一一一一．一一一一一一I．_．曼曼曼皇曼曼曼寡曼曼皇曼量曼皇鼍曼量曼曼曼曼暑曼曼寰曼皇曼曼ConstructionoftheExpressionVectorContainingaFusedPollenandSeed—SpecificP

6、romoterMajor：OlericultureCandidate：XiaofengWeiSupervisor：XingguoZhang(CollegeofHorticultureandLandscapeArchitecture，SouthwestUniversity,Chongqing400715，China)ABSTRACTSincethefirsttransgenicplantappearedintheearly1980s,itsbiosafetyrelatedtoenvironment,healthandtransgenetransfer

7、arousegrowingconcerning．Theenvironmentalsafetyoftransgenicplants，whichmeanshavingnotoxicaffectiononotherspeciesandincapableofhorizontalgenetransfer,isoneoftheprerequisitesforofficialapprovaloffieldreleaseandapplication．Practicaltechnicalapproachessuchaspollensterilization,seed

8、failureordeletionofforeignDNAsegmentsincertaindevelopmentalst