浅谈免疫介导的再生障碍性贫血小鼠模型胸腺tbet的表达水平

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1、浅谈免疫介导的再生障碍性贫血小鼠模型胸腺Tbet的表达水平再生障碍性贫血(AA)主要表现为骨髓造血功能低下、全血细胞减少和贫血、出血、感染综合征［1］。其发病机制目前不清楚，众多研究表明，细胞免疫异常是获得性AA发病机制中的主要环节［2］。AA的细胞免疫异常主要表现为Thl淋巴细胞数目增多和功能亢进。T?bet是2000年Szabo等［3］发现了的一种新的在CD4＋Th1细胞的分化中起重要作用的属于T?box家族的转录因子，是Thl细胞特异性转录因子。本文拟通过建立免疫介导的骨髓衰竭小鼠模型，观察模型小鼠的T?

2、bet蛋自在胸腺中的表达水平，以及其与中性粒细胞绝对值(ANC)、网织红细胞相对值、血小板数及血红蛋白的相关关系，了解T?bet蛋白在再障中的表达水平及与再障病情的相关性，为探讨再障的发病机制提供一些思路、线索。1资料与方法1.1实验动物与分组近交系DBＡ/2小鼠，10周龄，雄性，16～20g，2只，由北京维通利华公司提供。近交系BALB/c小鼠(H?2d，MLSb)(H?2b，MLSb指小鼠的遗传型)，20只，8周龄，雌雄各半，由中国辐射防护研究院提供。将BALB/c小鼠随机分为正常对照组和骨髓衰竭模型组，各

3、10只。1.2试剂与仪器SK?1250、M?MuLV逆转录酶均购自立陶宛Fermentas公司。SP法试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。T?bet单抗购于SantaCruzBiotechnology。DAB显色剂购于中国医学科学院生物工程研究所。1.3小鼠免疫介导骨髓衰竭模型将DBA/2小鼠(供鼠)颈椎脱臼法处死，常规消毒后，立即在超净工作台中无菌取出胸腺和淋巴结，剪碎，加少量PBS液，轻轻研磨后小筛网过滤，制成单个细胞悬液。台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞在95％以上。细胞计数并配制成所需浓度5106/mL

4、备用。AA造模参照目前常用免疫介导再障小鼠模型［4］：BALB/c小鼠，经5.5Gy60Coy射线全身一次性亚致死剂量均匀照射后，4h内经尾静脉输入DBA/2小鼠的胸腺淋巴结混合细胞悬液每只0.2mL，含细胞数为1106个，建立AA小鼠模型10只。1.4组织化学方法检测胸腺T?bet蛋白表达水平收集正常组和模型组小鼠胸腺，于体积分数为4％的多聚甲醛中固定8h，然后常规石蜡包埋、切片，按照免疫组化学试剂盒说明操作。免疫组织化学SP法具体步骤如下：组织常规脱蜡至水，3％H2O237℃下孵育30min，以消除内源性过

5、氧化物酶活性。蒸馏水冲洗1min，PBS浸泡5min，封闭液封闭：滴加正常山羊血清封闭，37℃30min，甩去多余液体，勿洗；滴加特异性一抗：滴加1∶50的兔抗鼠T?bet多克隆抗体，37℃孵育4min。PBS浸泡，5min3次；滴加生物素化山羊抗兔二抗IgG，37℃孵育30min，PBS浸泡，5min3次；滴加辣根标记链霉卵白素，37℃孵育20min。PBS浸泡，5min3次；DAB显色，镜下控制反应时间；自来水充分洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片；阳性结果判断标准及表达定量分析：以有棕黄色或棕黑色颗粒

6、为阳性细胞。400倍光镜下观察，从每张切片中于阳性细胞分布区随机选择5个不重复单位视野，以每个视野内的阳性细胞数作为T?bet蛋白的量化指标，计数每个单位视野的阳性率，阳性率＝阳性细胞数/(阳性细胞数＋阴性细胞数)100％，取其平均值。1.6统计学分析所有资料用SPSS13.0软件包进行分析，检测结果以±s表示，经方差齐性检验后，采用检验比较两组间差异，用简单直线相关分析探讨两因素之间相关关系的方向和程度。P＜0.05有统计学差异，P＜0.01有显著统计学差异。2结果2.1模型验证模型组小鼠自第5

7、天起出现食欲明显减退，自第8天陆续出现体重下降。造模后第12天将模型组和正常组BALB/c小鼠经尾静脉取血，肝素抗凝，做外周血网织红细胞计数(见表1)。将濒死小鼠或造模后第20天将所有小鼠颈椎脱臼法处死，常规乙醇消毒，取股骨，于中性甲醛中固定5h，然后在2％硝酸中脱钙2h，常规塑料包埋，切片，观察骨髓造血细胞和脂肪细胞。结果示：正常对照组小鼠骨髓增生活跃，脂肪细胞少见；模型组小鼠骨髓增生低下，主要为脂肪细胞，骨髓切片中微血管极度扩张、瘀血、断裂，微血管数明显减少，呈典型AA病理改变。表1AA组小鼠及正常小鼠组外

8、周血象及网织红细胞计数比较及Rc分别指外周血中性粒细胞、血红蛋白、血小板及网织红细胞。2.2胸腺组织T?bet蛋白的表达变化模型组T?bet蛋白的阳性率为(0.41±0.05)％，对照组为(1.06±0.18)％，两组胸腺组织石蜡切片T?bet蛋白的表达水平有显著差异，差异有统计学意义(P＜0.01)。2.3T?bet蛋白与造血功能的关系结果显示：T?bet