富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究

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1、富组蛋白5表达质粒构建及抗菌功能研究作者：李岩，李明　陈伟强，邝枣园，黄宁【摘要】目的构建富组蛋白5(histidinerichprotEin5,HRP5)重组表达载体，表达并纯化HRP5蛋白，观察其抗菌作用。方法用基因克隆的方法构建pET32aHRP5重组表达质粒，经IPTG诱导表达后，用亲和层析的方法纯化HRP5融合蛋白，TricineSDSPAGE电泳鉴定其分子量，琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果成功构建了pET32aHRP5表达质粒并表达、纯化出HRP5融合蛋白，融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌PAO1

2、有抗菌活性。结论HRP5是一种抗菌分子，参与了机体的天然免疫防御功能。【关键词】富组蛋白5;蛋白表达;亲合层析;抗菌活性Abstract:ObjectiveToexpressandpurifyrebinantHRP5protEInandinvestigateitsantimicrobialactivity.MethodsTherebinantprokaryoticexpressingplasmidpET32aHRP5icrobialactivityofHRP5atographyandshoonasaeruginosaPAO1.Conclus

3、ionHRP5proteinisapotentantimicrobialmoleculeanditisinvolvedinthedefenseoftheinnateimmunityinvivo.　　Keyatography;antimicrobialactivity　　富组蛋白(histidinerichproteins,HRPs)为一组分子量为3～5kD、分子中富含组氨酸的阳离子多肽，主要由灵长类动物腮腺和颌下腺分泌。1984年研究者首次报道了HRPs对变形链球菌、白色念珠菌有抑制生长和杀菌作用[1,2]，随后的研究显示HRPs作为一组内源性抗菌肽

4、，参与宿主非特异性免疫防御系统，与多种口腔感染性疾病密切相关。在至少由12种蛋白组成的HRPs家族中，HRP1、3、5作为主要富组蛋白，其蛋白质之和占HRPs总含量的85%以上。HRP5是HRP3的蛋白裂解产物，由HRP3N末端的24个氨基酸残基组成，是HRPs家族中抗菌效果最强的蛋白[3，4]。本实验利用基因克隆的方法构建了pET32aHRP5重组表达质粒，经IPTG诱导后，用亲和层析的方法获得纯化的HRP5融合蛋白，并用琼脂糖弥散法抗菌实验证实重组蛋白的抗菌功能。　　1材料　　1.1主要试剂　　琼脂糖、溶菌酶、胰蛋白胨、酵母提取物、大豆培

5、养基、过硫酸铵、Tris、Tricine(Sigma公司);丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、蛋白质Marker(Merck公司);考马斯亮蓝R250(上海试剂厂进口分装产品);连接试剂盒、限制性内切酶、Taq酶(Fermentas公司);质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒(Omega公司);IPTG(华美公司);引物、Trizol试剂、DEPC及两步法RTPCR试剂盒(Takara公司);HisTrapKit(Amersham公司);致病性大肠杆菌54299、绿脓杆菌PAO1、宿主菌DE3及原核表达质粒pET32a均为本室保存。　　1.2主要仪器

6、　　纯水仪(Millipore公司);超净工作台(苏净集团);PCR仪(Biometra公司);凝胶成相仪(Amersham公司);低压色谱仪(Amersham公司)。　2方法　　2.1HRP5分子片段的制备　　腮腺组织来源于人因腮腺纤维瘤切除腮腺的正常腮腺组织部分，按说明书用Trizol法提取总RNA为模板，以Oligod(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA。根据GeneBank(登陆号：BC009791，HRP3)设计特异性引物，上游引物P1：5’CCGGGATCCGATTCACATGCAAAGAGACA3’,含BamHⅠ酶切位点，下游

7、引物P2：5’CTGGAGCTCATCGCCTCGATGTGAATG3’。含SalⅠ酶切位点，扩增HRP3N末端的24个氨基酸编码序列。PCR反应条件为：95℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s，进行30个循环，最后在72℃延伸10min。PCR反应结束后，取5μL琼脂糖凝胶电泳鉴定，并进行纯化。　　2.2HRP5分子的连接转化　　纯化的扩增产物用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，然后按常规方法连接于同样双酶切的原核表达质粒pET32a载体。将连接产物转化入大肠杆菌DE3，挑取阳性菌落送Takara公司进行基因测序鉴

8、定。　　2.3重组融合HRP5蛋白的分离纯化和鉴定　　IPTG诱导大肠杆菌DE