唾液富组蛋白5表达载体的构建

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1、唾液富组蛋白5表达载体的构建【摘要】目的将唾液富组蛋白5cDNA克隆至表达载体pGEX4T1。方法EcoRⅠ+SalⅠ双酶切克隆载体pMD19Thrp5及pGEX4T1，回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX4T1，将二者连接后转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX4T1，无突变。结论重组载体pGEX4T1hrp5构建成功。【关键词】唾液富组蛋白5克隆表达载体ConstructionofExpressionVectorofSalivaryHis

2、tatin5ZHOUQi，JINKehua，LUODesheng，etal(StudentsofGrade2004,XianningUniversityMedicalSchool，XianningHubei437100，China)ABSTRACT：ObjectiveToclonethecDNAofsalivaryhistatin5toexpressionvectorpGEX4T1.MethodspMD19Thrp5andpGEX4T1weredigestedbySalⅠ+EcoR.Thedigestedhrp5andpGEX4T1wereli

3、nkedandtransformedtoE.coliDH5α，andthe9positivecolonieswerescreenedbyampicillin,andidentifiedbyPCR，digestionandsequencing.ResultsThecDNAofhitatin5wascorrectlyinsertedintoexpressionvectorpGEX4T1withoutmutation.ConclusionRecombinantvectorpGEX4T1hrp5wasconstructedsuccessfully.KEYWORD

4、S:SalivavryHistatin5；Clone；Expressionvector唾液富组蛋白5（HRP5）为富含组氨酸的阳离子多肽，存在于人类和灵长类动物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效杀灭耐药的白色念珠菌，且具有抗细菌、抗肿瘤及治疗关节炎的作用，作用机理独特，未发现毒副作用，不易诱导抗药菌株的产生，作为多肽类药物防治口腔等疾病潜力巨大[1]。唾液中HRP5含量低，采集唾液极为不便，提取过程繁琐，产率低；化学合成成本高；我们构建了含HRP5基因的原核表达载体，以望表达具有生物活性的HRP5。1材料与方法1.1材料克隆载体pMD19Thrp5为前期

5、构建[2]，原核表达载体pGEX4T1、大肠杆菌DH5α购自invitrogen公司，限制性内切酶、Taq9DNA聚合酶、质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒、酶购自宝生物（大连）公司。氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、YeastExtract、Tryptone、DNAMarker购自武汉凌飞科技公司，引物由上海英骏公司合成。1.2提取质粒pGEX4T1将含pGEX4T1的菌株于含Amp（100μg/ml）的固体LB培养基上划线，37℃倒置培养过夜。选择生长良好的单菌落，接种至4ml含Amp（100μg/ml）的LB培养基，37℃200转/min（rpm）振荡培

6、养12h。取1.5ml×2菌液，按试剂盒抽提质粒。1.3目的片段的酶切和回收按文献[2]体系，酶切5份克隆载体，合并反应液，沉淀后进行2％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，按试剂盒回收。1.4酶切表达载体并回收酶切体系如下：9pGEX4T16μl10×HBuffer6μlEcoRⅠ2μlSalⅠ2μldH2O44μl温和混匀，37℃水浴4h；加入120μl无水乙醇，6μl3mol/L醋酸钠，混匀，-80℃沉淀1h；12000rpm离心5min，弃乙醇，600μl70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min，弃乙醇，室温风干，加入20μldH2O溶解沉淀，0

7、.8％琼脂糖凝胶电泳分离，按试剂盒回收表达载体。1.5表达载体构建取目的片段及酶切载体各4μl，10×ligationbuffer1μl，T4DNAligase1μl，混匀，16℃连接过夜。转化DH5α感受细胞，于含Amp（100μg/ml）的LB培养基筛选阳性菌落。91.6重组表达载体的鉴定1.6.1PCR鉴定挑取阳性菌落，用鉴定引物P1:5′GTGAATTCGACTCTCATGCG3′,P2:5′ATGTCGACATAACCGCGATG3′PCR鉴定，反应体系：dNTPs（10mmol/L）1μl，10×buffer5μl，MgCl2（25mmol/L）3μl

8、，P1(5