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1、临床医学论文•唾液富组蛋白5表达载体的构建【摘要】口的将唾液富组蛋白5cDNA克隆至表达载体pGEX4T1。方法EcoRl+SalI双酶切克隆载体pMD19Thrp5及pGEX4T1,回收目的片段hrp5及双酶切载体pGEX4T1,将二者连接后转化大肠杆菌DH5a,氨节青霉索筛选阳性菌落，PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。结果唾液富组蛋白5的cDNA正确克隆至表达载体pGEX4T1,无突变。结论重组载体pGEX4T1hTp5构建成功。【关键词】唾液富组蛋白5克隆表达载体ConstructionofExpre
2、ssionVectorofSalivaryHistatin5ZHOUQi,JINKehua,LUODesheng,etal(StudentsofGrade2004,XianningUniversityMedicalSchool,XianningHubei437100,China)ABSTRACT:ObjectiveToclonethecDNAofsalivaryhistatin5toexpressionvectorpGEX4T1.MethodspMD19Thrp5andpGEX4T1weredigeste
3、dbySalI+EcoR.Thedigestedhrp5andpGEX4T1were1inkedandtvansformedtoE.coliDH5a,andthepositivecolonicswerescreenedbyampiciIlin,andidentifiedbyPCR,digestionandsequencing.ResultsThecDNAofhitatin5wascorrectlyinsertedintoexpressionvectorpGEX4T1withoutmutation.Conc
4、lusionRecombinantvectorpGEX4T1hrp5wasconstructedsuccessfully.KEYWORDS:SalivavryHistatin5；Clone；Expressionvector唾液富组蛋白5（HRP5）为富含组氨酸的阳离子多肽，存在于人类和灵长类动物腮腺唾液分泌物中。研究农明HRP5能有效杀灭耐药的白色念珠菌，冃具有抗细菌、抗肿瘤及治疗关节炎的作用，作用机理独特，未发现毒副作用，不易诱导抗药菌株的产生，作为多肽类药物防治口腔等疾病潜力巨大［1］。唾液+HRP5
5、含量低，采集唾液极为不便，提取过程繁琐，产率低；化学合成成木高；我们构建了含HRP5基因的原核表达载体，以望表达具有生物活性的HRP5o1材料与方法1.1材料克隆载体pMD19Thrp5为前期构建［2］,原核表达载体pGEX4T1、大肠杆菌DH5Q购自invitrogen公司，限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、质粒小提试剂盒、凝胶冋收试剂盒、酶购自宝生物（大连）公司。氨节青霉素（Amp）、琼脂糖、YeastExtractsTryptone>DNAMarker购自武汉凌飞科技公司，弓I物由上海英骏公司合成。
6、1.2提取质粒pGEX4T1将含pGEX4T1的菌株于含AmpdOOPg/mDtKl固体LB培养基上划线,37°C倒置培养过夜。选择主长良好的单菌落，接种至4ml含Amp(100ug/ml)的LB培养基，3TC200转/min(rpm)振荡培养12h。取1.5mlX2菌液,按试剂盒抽提质粒。1.3目的片段的酶切和回收按文献［2］体系，酶切5份克隆载体，合并反应液，沉淀后进行2%琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段，按试剂盒回收。1.4酶切表达载体并冋收酶切体系如下：pGEX4T16uI10XHBuffer6u
7、1EcoRI2H1SalI2p1dH2044u1温和混匀，37°C水浴4h；加入120u1无水乙醇，6叮3mol/L酷酸钠，混匀，・80°C沉淀lh；12000rpm离心5min,弄乙醇，600u170%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min,弃乙醇，室温风干，加入20u1dH20溶解沉淀，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，按试剂盒回收表达载体。取目的片段及酶切载体各4u1,10X1igationbuffer1u1,T4DNAligaselu1,混匀，16°C连接过夜。转化DH5。感受细胞，于含Amp(10
8、0ug/ml)的LB培养基筛选阳性菌落。1.6重组表达载体的鉴定1.6.1PCR鉴定挑取阳性菌落，用鉴定引物P1:5’GTGAATTCGACTCTCATGCG3’,P2:5’ATGTCGACATAACCGCGATG3'PCR鉴定，反应体系：dNTPs(10mmol/L)Im1,10Xbuffer5u1,MgC12(25mmol/L)3u1,Pl(5pmol/L)2u1,P2(5pmol/L)2叮，TaqDNA聚合酶(5U/u1
