大鼠牙囊细胞培养方法的探讨论文

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1、大鼠牙囊细胞培养方法的探讨论文【摘要】【目的】探讨大鼠牙囊细胞体外培养的方法。【方法】分离出大鼠牙囊组织，分别采用组织块培养法、细胞消化分散法、及改良组织块法进行牙囊细胞原代及传代培养，倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察，透射电镜观察细胞超微结构。【结果】培养至第3天，倒置相差显微镜观察发现，采用组织块培养法，见少数细胞从组织块爬出；而细胞消化分散法则可获得数量多的牙囊细胞，但与杂质细胞混杂生长；改良组织块法见量多、相对纯的牙囊细胞。电镜下牙囊细胞无桥粒.freelethodofratdentalfolliclecellsinvit

2、ro.【Methods】Thedentalfollicle(DF)tissuesarygenerationandpassageculturebymethodsofexplant,dissociationcellandimprovedexplant,respectively.Consequently,themorphologyoftheculturedfirstpassageDFcellsandtheirultrastructureicroscopeandtransmissionelectronicmicroscope,respect

3、ively.【Results】Atthethirddayinvitro,onlyafetheexplantbyanyDFcellsmixingpurecellsadheredprovedexplantatthesametime.Transmissionelectronmicroscopyshoicreticulum（RER）andnodesmosmoes.Atabout10th,7thand6thdayinvitro,DFcellseentratioofeighty,sixtyandonehundredpercentbyproved

4、explantculturerespectively.【Conclusion】ImprovedexplantcultureethodforratDFcells.Keyethodology牙囊对牙齿萌出起重要作用。牙萌出必须是在牙槽骨的吸收、形成牙槽骨的通道后，才能够完成这一生理过程1。Cahill和Marks2，3研究表明，以手术方法去除小鼠牙囊，牙齿则不能萌出；而保留牙囊，用其它物质替代牙胚，结果替代物可以萌出。Larson4在狗前磨牙牙冠形成后萌出前四周去除牙囊，牙齿同样不能萌出，将剥离的牙囊立即放回成釉器表面，牙齿即能重新萌出

5、。这些研究证明牙齿萌出依赖牙囊的存在。牙囊在牙齿萌出过程中，从组织、细胞和分子水平上对牙齿萌出起重要的调控作用5，6。目前关于牙囊细胞的体外培养，国内外报道尚不多7。本研究以SD大鼠为实验对象，采用组织块培养法、细胞消化分散法及改良组织块法培养大鼠牙囊细胞，比较不同方法的优缺点，以寻求培养牙囊细胞的最佳方法，为研究牙囊在牙齿萌出过程中的作用在细胞方面提供依据。1材料和方法1.1试剂、仪器及动物实验来源MEM培养基（GIBCO公司，美国），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），HEPES（Sigma公司，美国），胰蛋白酶（Advan

6、cedTechnologyIndustrialpany），左旋谷氨酰胺（GIBCO公司，美国），青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司），丙酮酸钠（Sigma公司，美国），PBS（北京中山生物技术有限公司），细胞培养瓶（Corning,.freelany），SD乳鼠（中山大学动物实验中心）。1.2牙囊组织的分离与获取取5只新生6或7d的SD乳鼠，引颈法处死后，用75%酒精浸泡2～3s，外科法取出下颌骨，置入D-Hanks’平衡盐溶液（含300U/mL青霉素，300μg/mL链霉素），在解剖显微镜下分离出下颌第1、第2磨牙牙胚。进一步在

7、解剖显微镜下分离牙囊与成釉器，将分离出的牙囊组织立即置入MEM培养基中（含300U/mL青霉素，300μg/mL链霉素，pH7.2）。用眼科剪将组织块切成1~2mm大小的块。1.3牙囊细胞原代培养1.3.1组织块培养法将上述方法获得的组织块离心5min，弃上清液，加入12%MEM培养基0.5mL，转入25cm2培养瓶中，用弯头吸管把组织小块摆布在培养瓶底上。小块相互距离0.5cm，轻轻翻转培养瓶，使牙囊组织贴附在培养瓶底，置入细胞培养箱中，于体积分数5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养。12h补加1.5mL培养液，2～3d换液1次，

8、细胞长满后传代，以1.25g/L胰蛋白酶和0.025%的EDTA（1∶1）液消化。1.3.2细胞消化分散法用眼科剪将组织块切成1～2mm大小的块，离心5min，弃上清液。1.25g/L胰蛋白酶消化10min，待组织块分散成细胞团或单个