多种属cpg odn诱导特异性抗体反应的研究

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1、多种属CpGODN诱导特异性抗体反应的研究【摘要】目的探讨人工合成的CpGODN对不同物种的免疫刺激活性，开发具有广谱免疫刺激活性的CpGODN。方法将特定的CpGODN单独或与不同的抗原联合分别免疫鸡和小鼠，用ELISA检测不同时间鸡和小鼠特异性抗体的滴度。结果CpGODN均能诱导鸡和小鼠产生抗原特异性抗体，且抗体水平明显高于对照组(P<0.05)。结论这种CpGODN在一定程度上具有广谱免疫刺激特性。【关键词】CpGODN；种属特异性；疫苗　　　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheimmunestimulationactivity

2、ofCpGoligodeoxynucleotidestodifferentspeciesanddevelopCpGoligodeoxynucleotidesthatpossessbroad-spectrumimmunestimulationactivity.MethodChickensandmicesofchickensandmiceice,andthelevelofantibodiesingroupsaderestrictivelypossessesbroad-spectrumimmunestimulationactivity.　　Keyultispeciesspeci

3、ficity；vaccine　　包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作为免疫刺激信号可以被动物的免疫系统所识别，随后CpGODN刺激人类和多种动物产生天然的和获得性的免疫应答。CpGODN主要通过TLR9活化免疫系统，产生Th1型免疫应答。因此，CpGODN作为佐剂已广泛应用于感染性疾病、肿瘤的预防和治疗［1］。但CpGODN存在种属特异性问题，这一问题限制了动物实验结论的外推性［2］。所以，寻找和开发具有广谱识别特性的CpGODN具有重要的应用价值。本文主要通过观察鸡和小鼠血清中特异性抗体的变化来评价CpGODN对不同抗原的免疫增强效果，进而确定这种CpGODN是

4、否能够克服物种限制性这一问题。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物健康1日龄小鸡，健康50日龄SPF鸡，购自广东省农科院；2月龄BALB/c小鼠,雌性,体质量20g左右，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号：2003A074。　　1.1.2试剂10mg/mL猪囊虫抗原、猪囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpGODN由本实验室保存［3,4］，SPAHRP购自上海生物制品研究所。　　1.2动物分组及免疫方案　　1.2.1鸡实验组取健康1日龄小鸡，随机分成A、B、C三个组，每组20只，各组饲养条件相同。7日龄时各组处理如下：A为对照组，不作任何处理；B组

5、滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）；C组滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）,并同时颈部皮下注射免疫佐剂CpGODN（100μg/kg），21日龄时B、C组按相同的处理加强免疫1次。　　1.2.2BALB/c小鼠实验组BALB/c小鼠60只,随机分为3组,每组间隔2周免疫2次。采用肌肉注射法,将质粒DNA溶液注射到小鼠两侧股四头肌。A组注射VR1020100μg/kg作为阴性对照;B组注射VTS76（100μg/kg）;C组注射VTS76和CpGODN各100μg/kg。　　1.3抗原特异性抗体检测　　96孔培养板用碳酸氢钠缓冲液(15mmol/LNa2CO3

6、,35mmol/LNaHCO3,PH9.6)适当稀释的猪囊虫抗原包被，4℃过夜孵育。用含Tol/LPBS，0.1%Tin；每孔加入100mL经PBS(0.1mol/LPBS，1%BSA)适当稀释的待测血清，37℃孵育2h。PBS洗涤5次，每孔加入100mL、1∶40稀释的SPAHRP，37°C孵育2h。PBS洗涤5次，每孔加入100mLTMB底物（含0.1mg/mL3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.4，用前加5mL30%H2O210mL），37℃孵育1h。每孔加入50mLH2SO4(0.2mol/L)终止显色反应。BioRad3550测定A4

7、50读数。待测样品A值大于阴性对照平均A值的3倍为阳性。　　1.4统计学分析　　各实验组数据比较均采用方差分析，P<0.05为差异有显著性。　　2结果　　2.1CpGODN对鸡血清中猪囊尾蚴特异性抗体滴度的影响　　C组在初次免疫1周后可以检测到特异性抗体，但抗体滴度很低；在初次免疫2周和二次免疫1周后，B组和C组特异性抗体滴度明显上升，且C组显著高于B组(P<0.05)；二次免疫后2周，B组还有明显上升，而C组已进入平台期，维持在一个较高的水平，两组之间差异无显著性(P>0.05)。对照A组在各个