cpgn odn对cpgs odn诱导hpbmc释放tnfα的抑制作用

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1、CpGNODN对CpGSODN诱导hPBMC释放TNFα的抑制作用作者：蒋为薇王良喜丁国富余双江【摘要】目的明确抑制性CpGODN208(CpGNODN)对刺激性CpGODN1826(CpGSODN)诱导单核/巨噬细胞分泌TNFα的影响，为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法选用本室前期筛选出的对CpGSODN活化RAC释放TNFα的影响；应用流式细胞术观察CpGNODN对CpGSODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果浓度比为1∶1的CpGNODN对刺激性

2、CpGSODN诱导hPBMC分泌TNFα具有抑制作用，并呈一定时效关系；CpGNODN对CpGSODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论CpGNODN对CpGSODN活化hPBMC具有抑制作用，这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpGSODN有关。【关键词】脓毒症抑制性CpGODN刺激性CpGODNTNFα表面结合内化ABSTRACTObjectiveTostudytheinfluenceofCpGODN208(CpGNODN)onTNFαreleasef

3、romhPBMCinducedbyCpGSODN1826(CpGSODN).MethodsCpGNODN,selectedbythepreviousRACinducedbyCpGSODNeasuredbyELISA.TheeffectsofCpGNODNonthesurfacebindingandinternalizationofCpGSODNetry.ResultsCpGNODNcouldinhibitTNFαreleasefromhPBMCinducedbyCpGSODNatthe

4、concentrationratio1∶1inatimedependentmanner.CpGNODNcouldinhibitthesurfacebindingandinternalizationofCpGSODN.ConclusionCpGNODNcouldinhibitTNFαreleasefromhPBMCinducedbyCpGSODN,icinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，由其发展来的多器官功能不全综合征(multipleorgandysfunc

5、tionsyndrome，MODS)病死率高达30%～50%，但目前尚无有效的防治措施［1］。细菌基因组DNA(细菌DNA)是SIRS的主要启动因子之一。未甲基化CpG的寡核苷酸片段(CpGoligonucleotides，CpGODN)是细菌DNA的免疫刺激作用的最小作用单位，广泛存在于细菌DNA中［2］。细菌DNA之所以被哺乳动物视作异己成分而启动防御反应，是因为其有着与不如DNA明显不同的结构特征：细菌DNA中的CpG二核苷酸出现的频率约为1/16，而哺乳动物DNA中的CpG二核苷酸出现的频率仅为

6、1/64，并且80%发生甲基化［3］。研究者们发现只有含有未甲基化CpG为核心的特定六核苷酸序列的CpGODN才具有刺激性，这些特定的六核苷酸被称为刺激性CpG基序(stimulatoryCpGmotif，CpGSODN)［3］。Krieg等通过对Adv2DNA、Adv5DNA、Adv12DNA和大肠埃希菌DNA发现部分CpGODN对细胞的刺激活性较弱，并能对CpGSODN活化细胞有抑制作用，因此推断这些序列可能是中和性CpG基序(neutralizingCpGmotif；CpGNODN)［4］。

7、由于上述研究中发现的CpGNODN活性并不稳定，因此在Krieg的研究基础上，我们进一步寻找并得到有效的CpGNODN：CpGODN208(5′TGCCGCGGCAGA3′)，CpGODN208对RAC)，观察CpGNODN对CpGSODN诱导hPBMC分泌TNFα的影响，进一步探讨其可能的作用机制。1材料和方法1.1材料全硫代修饰的CpGODN208(CpGNODN)：5′TGCCGCGGCAGA3′，由大连宝生物公司合成；全硫代修饰的CpGODN1826(CpGSODN)：5

8、′TCCCTGACGTTCCTGACGTT3′和6FAM标记的CpGODN1826由上海博亚生物技术有限公司合成。淋巴细胞分离液购自挪威AxisShield公司，比重1.077。RPMI1640培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自PAA公司。人TNFα检测试剂盒购自Bioscience公司。实验用移液管，吸管，离心管等玻璃器材均经260℃高温3h去热原处理；培养板购自BD公司，无热原，一次性使用。1.2hPBMC的分离按淋巴