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1、CpGODN对哮喘气道MMP[摘要]目的：探讨非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的寡核苷酸链(CpGODN)对哮喘气道重塑和气道基质金属蛋白酶9（MMP9）表达的影响。方法：以卵蛋白致敏激发的小鼠慢性哮喘模型为对象，观察对照组、哮喘组、CpGODN组及地塞米松组之间支气管壁厚度改变及气道MMP9表达。结果：(1)CpGODN组和地塞米松组的支气管壁厚度大于对照组而小于哮喘组（P＜0.05），而CpGODN组和地塞米松组间则无显著差异（P＞0.05）;(2)CpGODN组和地塞米松组MMP9表达高于对照组(P＜0.05)而小于哮喘组（P＜0.05），CpGODN组和地
2、塞米松组间则无显著差异（P＞0.05）。结论：慢性哮喘小鼠气道壁明显增厚，而早期行CpGODN干预则可抑制肺内MMP9的表达而减轻气道重塑。[关键词]哮喘；气道重塑；寡核苷酸链；基质金属蛋白酶9现在研究认为哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，反复炎症刺激可引起组织损伤及后续的组织结构改变即气道重塑[1]。炎症细胞及局部结构细胞如平滑肌细胞、上皮细胞等均可分泌大量介质，诱导细胞外基质金属蛋白酶及其抑制剂的表达，这些表达在哮喘的慢性病程中起重要作用[2]。含非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的寡核苷酸链（CpGoligodeoxynuleotides,CpGODN）能够刺激机
3、体产生多种细胞因子及表面粘附分子，诱导细胞及体液免疫，在治疗免疫性疾病、肿瘤及疫苗研究等方面有独特价值。本实验旨在利用卵蛋白致敏激发的小鼠慢性哮喘模型,探讨CpGODN对气道重塑有无抑制作用。1材料与方法1.1实验动物及试剂清洁级BALB/c小鼠28只,7周龄,体重16~20g，购于扬州大学比较医学中心[许可证号：SCXK（苏）20020009]。主要试剂包括鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)(Sigma公司Ⅱ级)，CpGODN(5′TCCATGACGTTCCTGACGTT3′)(上海生物工程技术服务有限公司),兔抗基质金属蛋白酶9（matrix
4、metalloproteinase，MMP9）多克隆抗体（SantaCruz公司），二抗试剂盒，3，3二氨基苯联胺（DAB），苏木素（北京中杉生物技术有限公司）。1.2实验方法1.2.1动物分组将28只小鼠随机分为哮喘组、CpGODN组、地塞米松组和对照组4组，每组7只。1.2.2哮喘动物模型制备小鼠于我校动物试验中心[使用许可证号：SYXK（苏）20020130]适应性饲养，温度22~27℃，湿度40%，灯光照明明暗各12h。1周后，采用卵蛋白致敏和激发建立哮喘小鼠模型[3]。哮喘组、CpGODN组、地塞米松组分别于第0、14天腹腔注射OVA10μg
5、加氢氧化铝2mg的生理盐水悬液0.1ml,同时CpGODN组给予CpGODN100μg。第15天开始以2.5%OVA雾化激发，30min・d-1,3d・周-1,共6周;地塞米松组每次激发前14h予2.5%地塞米松雾化10min;对照组全部以生理盐水代替。末次刺激后24h处死动物。1.2.3取材将动物颈椎脱臼处死，迅速打开胸腔，取出左肺投入10%中性福尔马林溶液中固定24h。肺标本严格于垂直位石蜡包埋，切片，片厚5μm。1.2.4光镜观察及气道形态学测定行HE染色,光镜观察肺组织病理学改变（观察倍数10×40）：取5个完整的支
6、气管横断面，且气管最小径/最大径≥0.5。参照文献[4]应用ImageProPlus4.5图像分析软件测定支气管基底膜周径(Pbm)、上皮黏膜层面积(WAmuc)、平滑肌面积(WAmus)、气管内壁面积(WAi),并用Pbm标准化，分别以WAmuc/Pbm、WAmus/Pbm、WAi/Pbm表示气道重构程度。1.2.5免疫组化方法（SABC法）测定一抗选用兔抗大鼠MMP9多克隆抗体，稀释度为1∶80。用二抗试剂盒进行操作,操作步骤按试剂盒说明书进行,DAB显色,苏木素轻度复染,光镜观察。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗而其他条件均相同,用Ima
7、geProPlus4.5软件采取图灰度值行图像分析。1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件，数据以x-±s表示，进行t检验、单因素方差分析,两两比较用q检验。2结果2.1肺组织病理学改变及图像分析光镜下观察,与对照组相比,哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚,黏膜下水肿,黏膜下层增宽,管腔狭窄,有时可见黏液栓堵塞,气道上皮细胞脱落,杯状细胞增多,黏膜下及管周有大量炎性细胞浸润,有时可见淋巴滤泡。CpGODN及地塞米松组较哮喘组上述改变明显减轻。图像分析地塞米松组和CpGODN组WAmuc/Pbm、WAmus/Pbm及WAi/Pbm较哮喘组明显降低
8、而高于对照组（P＜0.05)，地塞米松组和CpGODN组两者间无显著差异(P＞0.05)。结果
