cpg odn增强乙肝疫苗免疫反应的研究

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1、CpGODN增强乙肝疫苗免疫反应的研究作者：戴帆，董斌，郭晓磊，石碧珠，方丽娟，莫家琳，田素娟，孟民杰【摘要】　　目的研究人工合成的CpGODN对乙肝表面抗原的免疫增强效应，评价CpGODN的佐剂效应。方法将不同剂量特定的CpGODN与乙肝表面抗原联合免疫小鼠，用ELISA检测小鼠乙肝表面抗体的滴度。结果CpGODN联合乙肝表面抗原免疫小鼠，在短期检测中，高剂量组能较快的达到检测阈，各剂量组间抗体滴度检测值差异有显著性(P<0.05)，在长期检测中，各剂量组间抗体滴度检测值差异有显著性(P<0.05)，检测值随CpG剂量的增高而增大。结论CpGODN增强乙肝表面抗原的免疫反应短期和

2、长期都具有剂量效应。【关键词】CpGODN乙肝表面抗原免疫佐剂体液免疫　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofimmunologicalenhancementofHBsAgsofmicemunizetheBALb/cmice,thehighdosegroupcouldbedetectedquicklyinshotterm,thelevelsofantibodiesingroupsthelevelsofantibodiesingroupsmunologicaleffectofHBsAgs.　　Keymunoadjuvant;humoralimmu

3、nity　　CpG基序是一种具有非特异性免疫刺激能力的DNA序列，为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列。CpGODN(unmethylatedCpGmotifbasedoligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。CpGODN可刺激人类和多种动物产生自然免疫和获得性免疫，主要通过TLR9信号系统活化免疫系统，最终促使多种免疫细胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和DC细胞。CpGODN能快速活化T、B细胞，诱导Th1型免疫反应并能促进抗原递呈细胞的增生和成熟[1]。现阶段我国对乙型肝炎的预防主要是通过注射

4、乙型肝炎疫苗，但接种免疫过程中和接种免疫后会出现免疫较弱和不免疫现象[2,3]。所以，选择一种安全有效的免疫佐剂是增强免疫效果的有效途径。本文通过测定不同时间段的小鼠注射CpGODN和乙肝表面抗原后的抗体滴度，评价CpGODN作为免疫佐剂增强乙肝疫苗的免疫效果。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1动物BALb/c小鼠，雄性，6周龄，体质量18～22g，SPF级，购自中山大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)20040011。　　1.1.2试剂血源性乙肝表面抗原购自上海前尘生物，CpGODN由本实验室保存。　　1.2动物分组及免疫方案　　1.2.1动物分组50只BALb/c小鼠根据

5、随机分配表，随机平均分成5组：第1组为HBsAg和高剂量CpGODN联合免疫组，第2组为HBsAg和中剂量CpGODN联合免疫组，第3组HBsAg和低剂量CpGODN联合免疫组，第4组为HBsAg单用组，第5组为生理盐水对照组。各组饲养条件相同。　　1.2.2动物免疫分别于第0、2、4周免疫BALb/c小鼠，每次免疫剂量相同。第1组：尾静脉注射含2μgHBsAg和100μgCpGODN生理盐水溶液，100μL/只;第2组：尾静脉注射含2μgHBsAg和1μgCpGODN生理盐水溶液，100μL/只;第3组：尾静脉注射含2μgHBsAg和10ngCpGODN生理盐水溶液，100μL/

6、只;第4组：尾静脉注射含2μgHBsAg生理盐水溶液，100μL/只;第5组：100μL生理盐水/只。　　1.3乙肝表面抗原检测　　1.3.1血清采集断尾后玻璃毛细管采血，室温自然凝固，常温离心后取上清，-20℃保存。　　1.3.2抗原检测96孔板用碳酸氢钠缓冲液(15mmol/LNa2CO3，355mmol/LNaHCO3，pH9.6)适当稀释的乙肝表面抗原包被，4℃过夜孵育。用含Tol/LPBS,0.1%Tin，每孔加入100μL经PBS(0.1mol/LPBS,1%BSA)适当稀释的待测血清，37℃孵育90min。PBS洗涤5次，每孔加入100μL　　1000倍稀释的HRP标记的乙肝表面

7、抗原，37℃孵育40min。PBS洗涤5次，每孔加入100μLTMB底物(含0.1mg/mL3’3’5’5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.4，用前加5mL30%H2O210mL)，37℃孵育1h。每孔加入100μLH2SO2(0.2mol/L)终止显色反应。BioRad680测定A450/630读数。　　1.4统计学分析　　应用SPSS统计软件，采用重复测量方差分析对数据进行分析