雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响

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1、雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响作者：段小群，刘永明，卢曦，龚受基，陈薇【摘要】目的探讨雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响。方法以人肝L-02细胞作为研究对象，用四环素建立肝细胞脂肪变性模型。将实验分为诱导组，继续诱导组、脱离诱导组，用油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况，并测定细胞内甘油三酯(TG)含量的变化。结果雪灵芝提取物(20～60μg·ml-1)可明显降低细胞内TG值，并呈剂量依赖性。结论雪灵芝提取物通过减少细胞内TG的生成从而阻止肝细胞脂肪变性。【关键词】雪灵芝;四环素;甘油三酯　　A

2、bstract：ObjectiveTostudytheeffectsofArenariakansuensisextracts(AKS)onhepatocytesteatosisinducedbytetracyclineinvitro.MethodsSteatosismodelofhepatocytesestablishedbyaddingtetracyclinetothegroeasuredl-1)concentrationdependentlydecreasedthelevelofTGinhepatocytes.Conc

3、lusionAKScanpreventhepatocytefattydegenerationviainhibitingTGproduction.　　KeyascientificInc公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，酶联免疫检测仪Model-450(美国Bio-Rad公司)，旋转蒸发器(RE-52型，上海亚荣仪器厂生产)。　　1.2试剂雪灵芝，由西藏阿仲嘎保生物制品有限公司提供;1640培养液购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;血清购自海克隆生物化学制品(北京)有限公司;四环素(实验室用)购自生工生物工

4、程(上海)有限公司;油红O购自美国Sinma公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购自美国Amersco公司;甘油三酯(TG)测定试剂盒购自浙江东欧生物工程有限公司。　　2方法　　2.1肝细胞培养人正常肝细胞株L-02，购自中国科学院上海生命科学研究所，用含10%胎牛血清1640培养基传代培养。　　2.2雪灵芝提取物的制备将KAS全草粉碎，以6倍量的95%乙醇加热回流提取3次，1h/次，合并提取液，浓缩干燥得AKS乙醇提取物。残渣挥干乙醇，用6倍量的蒸馏水加热回流提取3次，1h/次，合并提取液，浓缩干燥得AKS水提取物。　　

5、2.3四环素浓度的确定将处于对数生长期的L-02细胞调整浓度为5×104个/ml培养于96孔板中，分别加入不同浓度的四环素(见表1)，用MTT[7]比色法测定细胞增殖情况(以吸收度OD值表示)。结合细胞形态观察，选择对细胞活性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度作为诱导细胞形成脂肪变性的最佳浓度。　　2.4雪灵芝提取物浓度的确定将处于对数生长期的L-02细胞调整浓度为5×104个/ml培养于96孔板中，分别加入不同浓度的雪灵芝提取物(见表2)，用MTT比色法测定细胞增殖情况(以吸收度OD值表示)。结合细胞形态观察，将对细胞活

6、性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度定为最高给药浓度。　　2.5肝细胞脂变模型的建立将处于对数生长期的L-02细胞分为两组，即：对照组、诱导组，使每组细胞浓度均为5×104个/ml。对照组：用正常培养基培养;诱导组：每毫升正常培养基中加四环素12μg培养。在各实验条件下培养48h，收集细胞冻融液，严格按照TG试剂盒规定操作，测定其中TG的含量。制备油红O染色[8]标本，观察细胞脂滴数的变化。　　2.6雪灵芝提取物对肝细胞脂变模型的影响将处于对数生长期的L-02细胞分为3组，使每组细胞浓度均为5×104个/ml。诱导组：损伤

7、同时加药治疗48h;继续诱导组：先损伤48h，再在损伤的同时加药治疗48h;脱离诱导组：先损伤48h，再加药治疗48h。每组内均设有空白对照、模型、阳性对照及高、中、低3个剂量组，在各实验条件下收集细胞冻融液，严格按照TG试剂盒规定操作，测定其中TG的含量。用100μg·ml-1烟酸作为阳性对照药。　　2.7数据处理所有数据均以±s表示，采用方差分析进行统计处理。　　3结果　　3.1四环素作用浓度的确定观察细胞形态发现，正常肝细胞为多边形，胞膜完整界限清楚，细胞浆丰富。四环素15μg·ml-1组细胞数量与正常细胞相比基本不

8、变，低倍镜下可见部分细胞形态有少许变化，但漂浮坏死细胞较少。30μg·ml-1组细胞增大变圆，数量有减少。120μg·ml-1组细胞多呈圆形或椭圆形，数量大大减少，细胞膜不完整，有破损(图1～3)。MTT实验检测结果提示：四环素浓度超过30μg·ml-1时吸收度(OD值)下降明显，对细胞增殖影响力较大(