hnadc1基因5’侧翼区转录调控序列系列载体构建与鉴定论文

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1、hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列载体构建与鉴定论文张剑凯，杨聚荣，李雪鹏，何娅妮【摘要】目的构建hNaDC1基因5’侧翼区转录调控序列系列萤火虫荧光素酶报告基因表达载体。方法PCR扩增获得hNaDC1基因5’侧翼转录调控区不同长度片段：hNaDC1A（-2232/+136，2368bp）、hNaDC1B（-1640/+136，1776bp）、hNaDC1C（-1084/+136，1221bp）、hNaDC1D（-253/+136，389bp）、hNaDC1E（-2232/-12.freelentsofhNaD

2、C1gene.MethodsTheDNAfragmentshNaDC1A~E(-2232/+136)in5’flankingregionofhNaDC1geneplifiedfromthenephridialtissuebyusingPCR.ThePCRproductsentsofhNaDC1genehadbeenconstructed.ConclusionTheseexpressionvectorsofferthebasicexperimentalconditionsforstudyingthedistributio

3、ncharactersofhNaDC1gene5’flankingregulationselementsandthepropertiesofinteractionsbetentsandregulationproteins.KeyanNa+/dicarboxylatecotransporter1，hNaDC1）是负责转运三羧酸循环中间代谢产物琥珀酸、枸橼酸和α酮酸等有机阴离子的低亲和力跨膜转运蛋白，主要分布于肾脏近端小管和小肠的刷状缘［1］。目前认为，钠离子依赖性二羧酸协同转运蛋白参与机体能量代谢、酸碱平衡调节以及哺乳

4、类动物寿限的调控等重要生命活动，可能与肾结石、代谢性酸中毒和衰老等病理生理过程密切相关［25］。然而迄今为止，hNaDC1基因的表达调控机制尚不清楚。本研究以萤火虫荧光素酶报告基因质粒为载体构建了hNaDC1基因5’侧翼转录调控序列系列缺失质粒，为进一步研究hNaDC1基因转录调控机制奠定基础。1材料与方法1.1细菌菌株、质粒及主要试剂E.coliJM109为第三军医大学野战外科研究所创伤烧伤复合伤国家重点实验室留存。萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3Basic、限制性内切酶KpnI和HindIII购自Promeg

5、a公司；Pfu高保真DNA聚合酶及相关PCR试剂购自Stratagene公司；T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Omega公司。琼脂糖、琼脂粉、酵母提取物及胰蛋白胨为Sigma公司产品。1.2PCR引物设计与合成根据转录因子预测软件MatInspector5.0和TRANSFAC4.0数据库预测结果（结果已另文发表），设计hNaDC1基因5’侧翼调控区序列相应的上、下游PCR引物，共5对。引物由上海生工公司合成。所有5’端引物均加KpnI酶切位点，所有3’端引物均加HindIII

6、酶切位点。引物序列及扩增片段大小见表1。表1hNaDC1基因5’侧翼不同长度片段引物序列信息1.3PCR扩增按常规酚抽提方法提取人肾组织基因组DNA，以此作为模板，添加相应引物，采用Pfu高保真DNA聚合酶扩增相应DNA片段，PCR条件为：94℃变性45s，58℃退火1min，72℃延伸5min，30循环；最后72℃延伸8min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相予以鉴定。1.4pGL3hNaDC1A～E表达载体的构建与鉴定pGL3Basic空白载体和PCR产物均用KpnI、HindIII双酶切，

7、回收pGL3Basic大片段和PCR产物，采用T4DNA连接酶将pGL3Basic片段分别与hNaDC1A～E各片段连接，转化DH5α感受态细菌。碱裂解法提取质粒，KpnI、HindIII双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色并照相予以鉴定重组子。重组子依次命名为pGL3hNaDC1A～E。送样宝生物公司(大连)测序。2结果2.1hNaDC1基因5’侧翼区序列的PCR扩增采用PCR法从人肾组织中扩增不同长度的hNaDC1基因5’侧翼转录调控区序列hNaDC1A～E，琼脂糖凝胶电泳显示获得的PCR产物的大小与设计

8、长度一致（图1）。2.2重组表达质粒载体的克隆与鉴定应用DNA重组技术，将PCR产物均用KpnI、HindIII双酶切，将纯化的hNaDC1A～E片段定向克隆到pGL3Basic表达载体中，构建重组表达载体pGL3hNaDC1A～E。重组质粒经KpnI、HindIII双酶切后的琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱见图2，可见重组表达质粒载体