猪cst b基因5＇侧翼区序列的克隆研究

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1、猪CstB基因5侧翼区序列的克隆研究王文涛，何鑫淼，张冬杰，彭福刚，吴赛辉，刘娣(黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086)摘要：以大白猪cDNA为模板，根据GenBank上提供的猪exonl序列设计引物，采用RACE克隆方法，首次获得猪tB基因5侧翼序列，得到了共4_4bp的序列，提交GenBank收录(GenBank登录号：EF483823)。关键词：CstB；RACE中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1000—7091(2010)增刊一0020—02TheResearchofCloneCstBGen

2、e5EndSequenceinPigWANGWen-tao，HEXin．miao，ZHANGDong-jie，PENGFu．gang，WUSai．hui，LIUDi(HeilongjiangAcademyofAcultureSciences，Harbin150086，China)Abstract：ThestudyfocusoncloningCstBgene5endsequenceinthepigbyRACEbasedonGenBankfAc—cessionNumber：DQ534493)．Researchersobt

3、aintheCstBgene5endsequenceof44bpandsubmitGenBank(AccessionNumber：EF483823)Keywords：CstB；RACE人们用候选基因法寻找和鉴别影响肌肉柔软的黑龙江省哈尔滨三元种猪场(纯种大白猪)。基因，发现了CstB作为候选基因，CstB是半胱氨1．2方法酸蛋白酶抑制剂家族(eystatin)成员之一，cystatin取猪肌肉组织样。TRIzol法提取总RNA，2％是溶酶体半胱氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶B，H，L和琼脂糖电泳验证RNA的完整性，并用光密

4、度读取S等)的内源性抑制剂，由一个大的超家族组成，包OD260与OD280，检测RNA质量，计算RNA浓度。括A，B，c等数种⋯。eystatinB(又称stefinB，以提取的总RNA为模板，使用5末端P标记的RTSTFB)主要抑制组织蛋白酶LJ，通过控制细胞内引物进行反转录反应，合成1stStrandeDNA，使用溶酶体蛋白酶的活性从而调控蛋白转换和酶原、激RNaseH分解HybridDNA—RNA中的RNA链，使用素原的加工【3J。CstB基因在人类中已经得到全序T4RNALigase使单链eDNA进行环化或形

5、成首尾列，共5873bp，含有3个外显子、2个内含子，3个连接物，以之为模板进行2次PCR扩增，产物回收、外显子的长度分别为66，t02，129bp。在猪上的研测序，使用操作按照说明书严格进行。究还不是很全面，只测得了第2内含子和第3外显根据GenBank上提供的猪的exon1序列(登录子，有待于更深人的研究。本研究以大白猪为试验号：DQ534493)设计引物。材料，采用5RACE克隆的方法，成功克隆了CstB序列如下：5末端P标记的RT引物：5一ACC基因的5侧翼序列。TGGCTC33"GAA-3。PCR扩增引物：

6、51引物：F：5一CCAGGCCAT1材料和方法CGCCGACAAGG一3。1．1材料R：5一CCTGGATCTCGGCCGTGG一3。TRIZOLReagent购自Invitrogen公司；5'-Full52引物：F：5．CTGGAGGAGAAGGTGAATRACECoreSet试剂盒、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、AAG-3；R：5一GGCTGCGTGGCGGAGGGC-3IODL2000Marker购自TaKaRa公司；柱式胶回收试剂按照5一FullRACECoreSet试剂盒操作手册进盒购自华舜公司。引物

7、合成和PCR产物克隆测序行操作，以大白猪的肌肉组织RNA为模板，以5末由上海英俊生物技术有限公司完成。试验样本采自端P标记反转录引物5．RT反转录，经过连接反应，收稿日期：2010一o4一o4基金项目：黑龙江省攻关项目(GB01B04)作者简介：王文涛(1981一)，男，主要从事动物遗传育种与繁殖研究。通讯作者：刘娣(1963一)，吉林四平人，女，博士生导师，教授，主要从事分子生物学研究。增刊王文涛等：猪CstB基因5侧翼区序列的克隆研究21●ORICULI'URAEDOREIRI—SlfllCli得到环化的cDNA

8、，以环化的eDNA为模板，51为进行测序，所得序列如下：CTGGAGGAGAAGGTGAA引物，进行PCR扩增，退火温度56~C，延伸1rain，获1’AAGACC，If】rCCCG【IG，I-I'CAAGGCCGTGGAGTrCAA得PCR产物。以51扩增PCR产物为模板，52为GAGCCACrGCTCCGCGACCGCCGCCCGGTGTC