缺氧调控报告载体的构建与鉴定论文

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1、缺氧调控报告载体的构建与鉴定论文杨洁，李占亭，杜德伟，柴青焕，王丽，张惠中，孙脊峰【关键词】荧光素酶Constructionandidentificationofhypoxiaregulatoryreportervectors【Abstract】AIM:Toconstructthefireflyluciferasereportergenevectorsregulatedbyhypoxiaresponsepromoters.METHODS:Theoligonucleotidesofhypoxiaresponseelement(HRE)andamutationcontro

2、lotersamplifiedbyPCRedigestion.Also,thesequencesofthevectorsotersakesitpossibletofurtherinvestigatetheirpotencyofhypoxiaregulation.【Keyents；luciferase；reportergene【摘要】目的：构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体.方法：合成缺氧应答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突变对照，克隆入pCIneo.freelent,HRE)是对缺氧可做出应激反应的缺氧反应基因内一段小于100bp的单拷

3、贝或多拷贝的顺式作用元件，能够与转录因子缺氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)结合，启动缺氧反应基因的转录，介导细胞对缺氧的反应［5-6］.本文将各种不同缺氧应答基因的HRE与CMV启动子组合成缺氧应答启动子，构建其荧光素酶报告载体，快速对该遗传调控元件进行功能性分析.1材料和方法1.1材料TaqDNA聚合酶及KpnⅠ，HindⅢ限制性内切酶购自TaKaRa公司.质粒小量制备与纯化试剂盒、PCR试剂购自天为时代公司.BglⅡ，SgfⅠ，IPpoⅠ限制性内切酶和pCIneo真核表达载体、pGL3Basic报告基因载体、JM109菌种由

4、Promega公司提供.HREs的正向和反向单链由博雅公司合成（两端带有限制性内切酶的粘端切口）.引物由奥科公司合成.测序由基康公司完成.其他试剂为进口或国产分析纯.1.2方法1.2.1HRE退火合成的HRE单链用去离子灭菌水稀释成3g/L，退火反应体系：正向单链2μL，反向单链2μL，1×退火液将总体积补至50μL（退火液的配方：醋酸钾0.98g，HEPES0.72g，KOH0.18g，醋酸镁0.043g，去离子水100mL，溶解后高压蒸气消毒，备用）.退火反应条件：95℃5min变性后，70℃10min，关掉水浴锅，缓慢降至4℃，过夜.1.2.2HRE/CMV重组

5、载体构建带有BglⅡ和SgfⅠ切口的HRE正向和反向单链退火成双链后定向克隆入经相应酶切去除CMV增强子的pCIneo载体，构建HRE/CMV重组载体，转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.1.2.3HRE/CMV报告载体的构建以测序正确的HRE/CMV重组载体为模板，设计并合成含KpnⅠ，HindⅢ限制性内切酶位点的引物，采用PCR方法克隆HRE/CMV调控序列.PCR反应体系：2×TaqPCRMasterMix，12.5μL；Primer1，1μL；Primer2，1μL；质粒模板，1μL；总体积，25μL

6、.PCR反应条件：95℃5min变性后，95℃，30s，68℃，45s，72℃，45s，30个循环.PCR产物经电泳凝胶回收后，进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切，定向克隆入经相应酶切的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3Basic，转化至JM109大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.2结果2.1HRE/CMV重组载体的鉴定合成的HRE正向和反向单链退火成双链后，与酶切后的pCIneo载体进行定向连接.利用酶切对载体进行鉴定，选择BglⅡ和IPpoⅠ两个酶切位点，可得到约280bp的片段.酶切后电泳如图1所示，可见到与预期值相符的

7、片段.测序结果也与设计序列完全相同.M:DL2000marker;1~6:HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF，EPO，hPGK，mPGK)（BglⅡ+IPpoⅠ）.图1pCIneoHRE/CMV的酶切鉴定图（略）2.2HRE/CMV报告基因载体的鉴定以HRE/CMV重组载体为模板进行PCR，预期可获得约150bp的HRE/CMV转录调控元件.如图2所示，可见与预期大小相符的片段.将回收的特异片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入pGL3Basic，转化后提取重组质粒酶切鉴定，如图3所示，可见与预期大小相符的片段.测序结果完全正确.3讨论作为