重组人微小染色体维持蛋白mcm5的原核表达和纯化

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1、重组人微小染色体维持蛋白MCM5的原核表达和纯化【关键词】MCM5蛋白；原核表达；纯化0引言MCM5蛋白是一种DNA复制调控蛋白，属于MCM蛋白质家族［1］。MCM5蛋白的表达作为一种增殖细胞的标记物受到关注，抗MCM5蛋白的抗体可以用来检测肿瘤细胞［2－3］。MCM5蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达，通过洗涤、层析可以得到纯度较高的MCM5包涵体蛋白［4］。本研究的成功为进一步进行相应抗体的制备奠定了基础。1材料与方法1.1材料大肠杆菌pBAD/ThioTOPO菌株和pBAD载体均购自Invitrogen公司。LArabinose为Sigma公司产品，NI

2、NTAHisBindSuperfloM)诱导表达，4h后收获细菌，称湿重，于-20℃冻存备用。1.2.3人MCM5蛋白表达菌的提取将1000ml培养菌离心后(约6g)加50ml缓冲液A(50mMTrisHCL，pH8.5，2mMEDTA,100mMNacl,0.5%TritonX100)，同时以1∶1000加入蛋白酶抑制剂(终浓度0.1mM)于冰浴中超声破碎，DNaseⅠ水解DNA。以12000r/min，4℃离心30min,弃上清。沉淀用含4M脲的TE洗液（10mMTrisHclpH8.0,1mMEDTA,4M脲）洗涤。4℃离心弃上清。用变性液（0.1M

3、TrisHclpH8.0，6M盐酸胍，2mMEDTA,0.5%βMe）溶解包涵体，室温放置2h。4℃离心保留上清。上清将作为层析分离纯化的蛋白样品。1.2.4人MCM5蛋白的纯化表达的融合蛋白的N端含有HisTag,故用金属Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。用含100mM咪唑的PBS洗脱目的蛋白，每管1ml。4℃透析过夜。再过SephadexG75分子筛柱进一步纯化、透析除盐,蛋白定量。2结果人MCM5的重组质粒pBAD/ThioTOPOMCM5转化TOP1O，经LArabinose诱导后可大量表达产物。SDSPAGE结果表明：最终的纯化表达产物显示出

4、分子量为39kD的一条蛋白条带，该分子量与预期结果一致，说明分离纯化是成功的。3讨论重组人MCM5蛋白在E.coli中的表达MCM蛋白首先在啤酒酵母中被发现，是一个关系密切序列高度保守的家族，由MCM2，-3，-4（Cdc21），-5(Cdc46),-6(Mis5),和-7(CDC47)六个保守亚基组成六聚体，表现复制型DNA解旋酶的活性[5]。其中MCM5用于表达相当恒定而受到关注，其染色体定位为22q13.1→q13.2，由734个氨基酸组成。研究证明，抗MCM5抗体可以作为增殖细胞的标志物，应用于组织学和细胞学标本的检测[2]。我们构建了人MCM5蛋白的第36

5、7～582位的氨基酸，并成功表达出pBADMCM5重组蛋白。本研究利用原核载体pBAD在E.coliTOP10中高效表达并纯化了融合蛋白pBAD/ThiMCM5。所选用的pBAD/TOPOThioFusionTM表达系统含有一个LArabinose的启动子，只有加入诱导剂LArabinose后，目标蛋白才能得以表达。目标蛋白为不可溶性蛋白，以包涵体的形式存在，不溶原因是在宿主系统高水平表达的重组蛋白合成速度太快，没有足够的时间进行折叠二硫键不能正确配对，过多的蛋白间的非特异性结合，以及重组蛋白无法达到足够的溶解度。细胞裂解后离心弃上清，将得到的沉淀溶于缓冲

6、液，再次洗涤离心。由于pBAD/TOPOThioFusionTM表达系统所表达的融合蛋白含有Histag结构，因此通过Ni2+柱进行纯化，可得到纯化的MCM5蛋白，通过稀释变性剂的浓度和透析除去变性剂，使目标蛋白恢复到有功能的高级结构。重组人MCM5融合蛋白的高效表达和纯化为下一步制备抗体奠定了基础。【参考