rtpcr检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达论文

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1、RTPCR检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达论文耿会珍刘明岩赵丽君刘珍刘燕翔黄宁王伯瑶吴琦【摘要】目的：检测人膀胱上皮细胞(T24细胞)是否表达双功能氧化酶(Duox1、Duox2)，并观察炎症细胞因子及佛波酯(PMA)对基因表达水平的影响。方法：体外培养人膀胱上皮(T24)细胞，经佛波酯(PMA)、炎症细胞因子(TNFα及IFNγ)刺激后提取细胞总RNA，采用半定量RTPCR方法观察细胞Duox1，Duox2mRNA表达水平。结果：Duox1，Duox2mRNA在T24细胞中组成

2、性表达，在佛波酯(PMA)、TNFα及IFNγ作用下，Duox2基因表达水平明显增加.freela公司，细胞因子(TNFα、IFNγ)为PeproTech公司产品，Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转试剂盒购自MBI公司，TaqmixDNA聚合酶，DL2000DNAMarker为天根生物技术有限公司产品，PCR引物由Invitrogen公司合成。1.2方法1.2.1细胞培养及刺激T24细胞采用含有10%新生小牛血清的1640培养基(无抗生素)常规培养和传代。实验前在每个细胞培养

3、皿(60×15mm)中接种30万个T24细胞，37℃5%CO2孵箱培养24h。加入PMA(浓度为5nM)或细胞因子(TNFα20ng·ml-1+IFNγ20ng·ml-1)，分别在刺激后的12、24h收集细胞抽提RNA。实验同时设无刺激的空白对照组。1.2.2PCR引物设计根据GenBank的序列，用Prime5.0软件分别设计Duox1(登录号AF213465)，Duox2(登录号AF267981)，βactin(登录号BC016045)的引物。表1PCR引物序列基因上游引物下游引物片段长

4、度(bp)Duox15'cgacattgagactgagttga3'5'ctggaatgacgttaccttct3'106Duox25'aacctaagcagctcacaact3'5'cagagagcaatgatggtgat3'109βactin5'cgggaaatcgtgcgtgac3'5'tggaaggtggacagcgagg3'4431.2.3总RNA提取按Trizol试剂说明操作。贴壁T24细胞直接用Trizol试剂裂解，提取的总RNA用异丙醇沉淀，溶于经过DEPC处理的水中，紫外分光光

5、度计检测其含量及纯度。1.2.4逆转录反应在0.5ml的Eppendorf管中加入RNasin0.5μl，Oligo(dt)1μl，总RNA1μl，MgCl24μl，10(buffer缓冲液2μl，逆转录酶1μl，用DEPC处理过的水补足至总体积20μl，混匀，42℃反应40min，95℃5min终止反应，冰浴冷却5min，-70℃保存。1.2.5PCR扩增Taqmix酶12.5μl，cDNA2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，加水补足总体积25μl。Duox反应程序：94℃10min，

6、94℃45s，53℃45s，72℃1min，40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。βactin反应程序：94℃3min，94℃30s，62℃30s，72℃1min,27个循环，72℃5min，4℃保存。1.2.6PCR产物的鉴定取5μlPCR产物，加1μl6×loddingbuffer，以1×TAE电泳缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上电泳约60min，BioRad凝胶图像分析仪拍照，QuantityOne分析软件对PCR扩增产物的特异性条带进行灰度扫描，以βactin产物作校正分析，计算目的

7、基因与内参照βactin灰度比。1.3统计学处理利用SPSS软件13.0对数据进行统计学处理。2结果2.1总RNA的鉴定实验提取的细胞总RNA用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值在1.79-1.90之间，表明所提RNA的纯度较高，蛋白质和DNA污染少。从凝胶电泳上可以清晰看到28sRNA和18sRNA两条带(图1)，其亮度之比约为2∶1，5sRNA带不明显，表明RNA没有降解。2.2RTPCR扩增结果PCR扩增结果显示Duox1，Duox2在T24细胞中有组成性表达(Construc

8、tiveexpression)。佛波酯(PMA)刺激后，Duox1基因表达无明显改变，而Duox2基因表达增加，并以细胞刺激后12h表达量最高，与未刺激对照细胞相比增加4.5倍(P0.05)(图2)。3讨论吞噬细胞(中性粒细胞、单核/巨噬细胞)杀菌机理研究揭示，通过细胞呼吸爆发产生大量超氧阴离子和活性氧(ROS)，是吞噬细胞重要的杀菌方式。NADPH氧化酶(NADPHoxidase)是吞噬细胞呼吸爆发的关键酶，该酶在吞噬细胞特异表达。基因突变而使NA