rtpcr检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达

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1、RTPCR检测人膀胱上皮细胞双功能氧化酶表达作者：耿会珍刘明岩赵丽君刘珍刘燕翔黄宁王伯瑶吴琦【摘要】目的：检测人膀胱上皮细胞(T24细胞)是否表达双功能氧化酶(Duox1、Duox2)，并观察炎症细胞因子及佛波酯(PMA)对基因表达水平的影响。方法：体外培养人膀胱上皮(T24)细胞，经佛波酯(PMA)、炎症细胞因子(TNFα及IFNγ)刺激后提取细胞总RNA，采用半定量RTPCR方法观察细胞Duox1，Duox2mRNA表达水平。结果：Duox1，Duox2mRNA在T24细胞中组成性表达，在佛波酯(PMA)、TN

2、Fα及IFNγ作用下，Duox2基因表达水平明显增加，而Duox1基因表达水平无明显变化。结论：双功能氧化酶Duox1和Duox2基因在膀胱上皮细胞表达，并受炎症刺激的影响，其在膀胱上皮细胞中的生理功能值得深入研究。【关键词】膀胱上皮细胞;双功能氧化酶;基因表达吞噬细胞NADPH氧化酶被激活后，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧(ROS)，成为细胞杀灭微生物的重要成分。2000年以后，在非吞噬细胞发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPHoxidase)家族。人类NOX家族共有7个成员，即NOX1、NOX

3、2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox82[1-3]。NOX家族广泛表达于机体的组织器官，其生物学功能成为研究的热点。双功能氧化酶(Duox1和Duox2)最初在甲状腺中发现，它们除了具有NOX的C端结构域外，还有一个N端过氧化物酶样胞外域，故称为双功能氧化酶。近年来，呼吸道、胰腺、腮腺、前列腺及肠胃道上皮等部位陆续发现Duox基因表达。泌尿道上皮是否表达Duox目前未见文献报道，本实验利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)的方法，观察膀胱上皮细胞中是否存在Duox表达，并初步探讨基因的表达调控因素。　　1材料

4、与方法　　1.1材料人膀胱上皮细胞株(T24)为本实验室保存，RPMI1640为GIBCO产品，新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，佛波酯(PMA)购自sigma公司，细胞因子(TNFα、IFNγ)为PeproTech公司产品，Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转试剂盒购自MBI公司，TaqmixDNA聚合酶，DL2000DNAMarker为天根生物技术有限公司产品，PCR引物由Invitrogen公司合成。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及刺激T24细胞采用含有10%新生小牛血清的1640培养基(无抗生

5、素)常规培养和传代。实验前在每个细胞培养皿(60×15mm)中接种30万个T24细胞，37℃85%CO2孵箱培养24h。加入PMA(浓度为5nM)或细胞因子(TNFα20ng·ml-1+IFNγ20ng·ml-1)，分别在刺激后的12、24h收集细胞抽提RNA。实验同时设无刺激的空白对照组。　　1.2.2PCR引物设计根据GenBank的序列，用Prime5.0软件分别设计Duox1(登录号AF213465)，Duox2(登录号AF267981)，βactin(登录号BC016045)的引物。　　表1PCR引物序列　　基因上

6、游引物下游引物片段长度(bp)Duox15'cgacattgagactgagttga3'5'ctggaatgacgttaccttct3'106Duox25'aacctaagcagctcacaact3'5'cagagagcaatgatggtgat3'109βactin5'cgggaaatcgtgcgtgac3'5'tggaaggtggacagcgagg3'4431.2.3总RNA提取按Trizol试剂说明操作。贴壁T24细胞直接用Trizol试剂裂解，提取的总RNA用异丙醇沉淀，溶于经过DEPC处理的水中，紫外分光光度计检测其含量

7、及纯度。　　1.2.4逆转录反应在0.5ml的Eppendorf管中加入RNasin0.5μl，Oligo(dt)1μl，总RNA1μl，MgCl24μl，10(buffer缓冲液2μl，逆转录酶1μl，用DEPC处理过的水补足至总体积20μl，混匀，42℃反应40min，95℃5min终止反应，冰浴冷却5min，-70℃8保存。　　1.2.5PCR扩增Taqmix酶12.5μl，cDNA2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，加水补足总体积25μl。Duox反应程序：94℃10min，94℃45s，53℃45s，72℃1m

8、in，40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。βactin反应程序：94℃3min，94℃30s，62℃30s，72℃1min,27个循环，72℃5min，4℃保存。　　1.2.6PCR产物的鉴定取5μlPCR