sirna干扰adar1表达对小鼠混合淋巴细胞培养的影响论文

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1、siRNA干扰ADAR1表达对小鼠混合淋巴细胞培养的影响论文蔡磊，霍斌亮，张巍，张福琴，赵青川【关键词】淋巴细胞培养试验,混合；RNA干扰；ADAR1基因；siRNA；排斥反应EffectofsiRNAmediatedsilencingofADAR1geneonmixedmouselymphocyteculture【Abstract】AIM:Toinvestigatelymphocyteproliferationixedlymphocyteculturetest.METHODS:Primarylymp

2、hocyteBalb/candC57mice.ADAR1siRNAphocytecellusingLipofectamine2000beforetphocytesixedandcultured.Thecellmorphologyicroscope,thecellproliferationinedbyMTTassay.TheADAR1mRNAphocyteproliferationixedlymphocyteculturetest.CONCLUSION:ADAR1hasapotentialroleint

3、heproliferationofmouselymphocyte.【Keyphocyteculturetest,mixed;RNAi;ADAR1;siRNA;rejection【摘要】目的:研究靶向ADAR1基因的siRNA在小鼠双向混合淋巴细胞培养中所扮演的角色.方法：将化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA在Lipofectamine2000介导下转染处于双向混合淋巴细胞培养试验中的小鼠淋巴细胞，观察转染组与未转染组细胞表型的变化；通过RTPCR检测两组细胞中ADAR1mRNA的变化；细胞计数和

4、台盼蓝拒染法检测靶向ADAR1基因的siRNA对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法评价转染化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA后对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用.结果：在经典淋巴细胞混合培养试验中，转染靶向ADAR1基因的siRNA可以明显降低小鼠淋巴细胞内ADAR1的表达，同时ADAR1siRNA对小鼠淋巴细胞的增殖有抑制作用.结论：在经典淋巴细胞混合培养试验中,化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA能有效抑制ADAR1基因在小鼠淋巴细胞中的表达.freelinaseactin

5、gonRNA,ADAR)，它以脱氨的方式对RNA中的核苷酸起转化或修饰作用，使RNA特异位点腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷，进而改变遗传密码，使编码的蛋白质结构和功能也发生改变.RNA干扰技术(RNAinterfering,RNAi)是近年来研究基因表达调控的新技术，其机制是将序列特异性双链RNA导入有机体，使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性沉默.我们应用RNAi技术借助混合淋巴细胞培养试验模型研究靶向ADAR1的siRNA对小鼠淋巴细胞功能的影响,为器官移植术后急性排斥反应的治疗提供新的治疗手段.

6、1材料和方法1.1材料Balb/c小鼠及C57小鼠各4只，雄性，18~25g（第四军医大学实验动物中心），淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司），DMEM培养基（Gibco公司）,Lipofectamine（Invitrogen公司），化学合成的ADAR1SiRNA片段由广州锐博生物科技有限公司提供,反转录试剂盒和PCR试剂（TOYOBO公司），ADAR1及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成.Mastercylerep型PCR扩增仪（Eppendorf公司），EPS2A200型电泳仪（

7、AmershamBiosciences公司号），凝胶成像系统为上海复日科技有限公司FR200全自动紫外与可见分析装置，550型酶联免疫检测仪（BIORAD公司）号，1100pro型分光光度仪（Ultrospec公司）.1.2方法1.2.1siRNA的设计和配制及引物的合成选定ADAR1基因（GENEBANK编号：NM_019655）的1824～1842处作为靶序列，设计siRNA序列为：正义链5′CCAGUACUGUGUAGCAGUAdTdT3′，反义链3′dTdTGGUCAUGACACAUCGUCA

8、U5′.内参照引物和ADAR1基因PCR扩增产物设计与合成.根据GenBank上发表的GAPDH和ADAR1序列,利用PrimerPremier5.0软件设计可以扩增的引物：GAPDH上游引物为5′CATCACTGCCACCCAGAAGA3′,.freelin离心25min后液体分为3层，取中间云雾状细胞层，Dhanks液洗2遍，将细胞重悬于含100mL/L小牛血清的DMEM培养基中，计数后混合两种小鼠的淋巴细胞,调整细胞数为1.7×109/L.在6孔板