sirna抑制adar1的表达对混合培养的小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响论文

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1、siRNA抑制ADAR1的表达对混合培养的小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响论文霍斌亮蔡磊马俊张福琴赵青川【摘要】目的：探讨RNA编辑酶ADAR1的表达受抑制后，小鼠淋巴细胞的细胞周期和细胞凋亡的变化.方法：用电转法将ADAR1特异性siRNA转入到处于混合培养的小鼠淋巴细胞中，培养48h，RTPCR检测转染效率；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化；RTPCR检验周期蛋白D1（cyclinD1）基因和周期蛋白A1（cyclinA1）基因表达量的变化.结果：转染ADAR1特异性siRNA48h后，小鼠淋巴细胞G0/G

2、1期细胞量增加，S期细胞量减少，G2/M细胞量保持恒定.另外，cyclinD1基因的表达量降低而cyclinA1基因表达保持恒定.结论：处于经典混合培养体系下的小鼠淋巴细胞.freelinase1）是近来研究最为重要的一种RNA编辑酶，目前发现它与众多疾病的发生进展有关［1-3］.ADAR1是通过脱氨基的方式使RNA特异位点腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷，从而改变RNA的遗传密码，进而使其编码的蛋白质结构和功能也发生改变.RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA

3、（doublestrandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象.SmallinterferingRNA(siRNA)是一种小RNA分子（21~25核苷酸），能介导识别并靶向切割同源性mRNA，高效抑制靶mRNA的表达.我们应用RNAi技术借助混合淋巴细胞培养试验模型研究ADAR1特异的siRNA对小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响,进一步揭示ADAR1在移植排斥中的作用.1材料和方法1.1材料BALB/c和C57小鼠，雄性，18～25g，各5只(第四军医大学实验动物中心)，淋巴细胞分离液

4、(上海华精生物高科技有限公司)，DMEM培养基(美国GIBCO公司),标准胎牛血清(天津市颢阳生物制品科技责任有限公司),ADAR1特异的siRNA片段及阴性对照siRNA（广州锐博生物科技有限公司）,反转录试剂盒（Fermentas公司），2×TaqPCRMasterMix（北京天为时代科技有限公司），4308电转电融合仪（Eppendorf公司），Mastercylerep型PCR扩增仪(Eppendorf公司)，EPS2A200型电泳仪(AmershamBiosciences公司)，FR200凝胶成像系

5、统（上海复日科技有限公司），1100pro型分光光度仪(Ultrospec公司)，318K型离心机(Sigma公司)，流式细胞仪（BD公司）.1.2方法1.2.1引物及引物设计ADAR1及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成,ADAR1基因上游引物5′CCTGTCAGCGGGTTGTTAGAGTA3′，下游引物5′TGGGAGCCATAGATTCATCAAGT3′，产物长度是610bp；GAPDH上游引物5′CATCACTGCCACCCAGAAGA3′，下游引物5′TGAAGTCGCA

6、GGAGACAACC3′，产物长度为320bp；siRNA的正义链(5′3′)：CCAGUACUGUGUAGCAGUAdTdT，反义链(3′5′)：dTdTGGUCAUGACACAUCGUCAU；阴性siRNA产品名称NControl_05815，产品编号2005815122147.CyclinD1，cyclinA1的基因序列来源与GenBank，引物由PrimerPremier5软件设计，cyclinD1基因的上游引物5′CAGCCCTGTTACCTGATACCT3′，下游引物5′TCCCAAGC

7、ACCTCATACTACC3′，产物长度是517bp；cyclinA1基因的上游引物5′GTAACGGAGTATGCAGAGGAG3′，下游引物5′AAATGCCAGGACTTTGAGTAG3′，产物长度是390bp.1.2.2小鼠淋巴细胞分离将BALB/c小鼠和C57小鼠分别脱颈处死，750mL/L乙醇浸泡5min，无菌取脾，Dhanks液冲洗1次，含青霉素、链霉素的双抗溶液冲洗1次，放入6cm培养皿中，加入3mLDhanks液，眼科剪将脾脏剪碎，玻璃空针针芯将碎片压碎，用400目塞网过滤，将滤

8、得的液体以1∶1的比例小心加于小鼠淋巴细胞分离液的液平面上，2500r/min离心25min，取中间云雾状细胞层，加入适量Dhanks洗涤，1000r/min离心10min，得白色细胞沉淀，以同样的方法将所得沉淀洗涤两遍，然后将细胞重悬于含100mL/L胎牛血清的DMEM，计数.将BALB/c小鼠细胞密度调整为1.5×109/L,C57小鼠细胞密度调整为2×109/L,按1∶1比例混