锌指蛋白基因抑制人平滑肌细胞表型转化的实验研究论文

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1、锌指蛋白基因抑制人平滑肌细胞表型转化的实验研究论文柏力，糜建红，杨明粲，张伟【摘要】目的探讨锌指蛋白基因A20抑制氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞增殖及表型转化的影响。方法用DOTAP脂质体转染pEGFPEHA20N1原代培养的平滑肌细胞，经G418筛选，A20表达经免疫荧光鉴定。Brdu检测转染前后氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞增殖情况及αSMactin抗体检测细胞表型转化情况。结果A20基因在平滑肌细胞得到有效表达，少量的氧化型低密度脂蛋白能诱导平滑肌细胞增殖，平滑肌细胞αSMactin骨架蛋白表达减少.freelineth

2、eeffectivenessofzincfingerproteinA20ininhibitingtheproliferationandphenotypechangingofOxLDLinducedsmoothmusclecells.MethodsSmoothmusclecellsoothmusclecellsinedbyfluorescenceanalysis.TheproliferationandphenotypechangingintransfectedanduntransfectedOxLDLinducedsmoothmuscle

3、cellsinedbyimmunofluorescenceanalysis.ResultsA20genecansignificantlyinhibittheproliferationandphenotypechangingofOxLDLinducedsmoothmusclecells.ConclusionA20geneisconducivetothetreatmentofatherosclerosis.Keyoothmusclecellsprolifrationphenotype动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发展与

4、氧化修饰低密度脂蛋白(oxidizedloershamPharmaciaBiotech，pEGFPEHA20N1质粒为本实验室保存。G418购自美国Gibico公司，DMEM培养基及胎牛血清为HLycone公司产品，Brdu抗体、Cy3免疫荧光试剂盒、αSMactin抗体为博士德产品。1.2DOTAP脂质体介导的锌指蛋白基因转染原代培养人平滑肌细胞，保持无菌条件取人脐静脉，用消毒PBS液反复冲洗管腔，清除管腔中的血凝块，待冲洗干净后再分离脐动脉，将脐动脉中膜在手术显微镜下分离出来，取一块组织放入无菌小烧杯，用酶消化法(大豆胰蛋白酶抑制

5、剂1mg/mL，弹性蛋白酶1mg/mL，胶原酶3mg/mL，牛血清白蛋白1mg/mL)分离VSMC，然后将分离的细胞中加入低血清1640培养液进行培养。采用αSMactin(Sactin)抗体做免疫组织荧光化学染色鉴定原代培养的平滑肌细胞是否符合需要。1.3细胞转染和筛选、培养用胰酶消化原代培养的平滑肌细胞，然后将其种植在培养玻片上。转染方法采用DOTAP脂质体介导法，在原代培养的SMC进行pEGFPEHA20N1质粒转染，大约8h后将转染液去掉，采用低血清的1640培养液继续培养1～2d后换液，细胞筛选采用含G418600μg/m

6、L的1640培养液培养，1～2周后收集能抵抗G418的细胞。对照组中也同样要用含G418600μg/mL的1640培养液进行选择性培养。荧光显微镜检测转染A20重组质粒的抗G418活细胞GFP表达情况，对照组为转染空载体、未转染的细胞。后续实验选用高表达锌指蛋白A20基因的抗G418阳性细胞。1.4OxLDL的制备OxLDL购自协和医科大学生物化学教研室，氧化试验在本实验室进行，主要方法是添加铜离子至终浓度为1μmol/L，在37℃条件下氧化24h。试验分组如下：原代培养的SMC分两组，一组为A20基因组，另一组为空载体pEGFPN1组。

7、在同等条件下每组再分别以不加任何刺激因素作为对照和加OxLDL10mg/L。1.5细胞增殖实验用Brdu检测种植在玻片上的原代细胞，在加入Brdu2h后用4%多聚甲醛固定，按常规免疫荧光方法检测，一抗为鼠抗Brdu单克隆抗体，二抗、三抗分别为生物素化的羊抗鼠IgG和SABCcy3，荧光显微镜观察计数。转染pEGFPN1及未转染细胞作为对照。1.6αSMactin骨架蛋白检测4%多聚甲醛固定玻片上的原代细胞，按常规免疫荧光方法检测，一抗为鼠抗人αSMactin单克隆抗体，二抗、三抗分别为生物素化的羊抗鼠IgG和SABCcy3，激

8、光共聚焦荧光显微镜照相。转染pEGFPN1及未转染细胞作为对照。1.7统计学方法采用SPSS6.0统计软件处理所有数据，以均数±标准差(±s)表示，行t检验。2结果原代培养的S