用积分法考察黄嘌呤对candida species尿酸酶的抑制作用论文

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1、用积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用论文【关键词】尿酸酶CharacterizationofinhibitionofxanthineonCandidaspeciesuricasebyintegratedmethod【Abstract】AIM:Toinvestigatetheprerequisiteoftheintegratedmethodforcharacterizinginhibitorsodel.METHODS:Uricasereactioncurveonitoredbyabsorbanceat293nm.Theapparentkiic

2、parameters(apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp,andapparentmaximalreactionrate,Vmapp)atedbynonlinearfittingreactioncurvetotheintegratedMichaelisMentenrateequatione.Theinhibitiontypeandinhibitionconstant(Ki)inedbasedontheresponsesofapparentkiicparameterstoxanthineconcentrations.RESULTS:

3、Outliersinreactioncurvegreatlyreducedthereliabilityofparametersobtainedbythisintegratedmethod.ichaelisMentenconstant,Kmapp)和表观最大反应速度(apparentmaximalreactionrate,Vmapp).据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibitionconstant,Ki).结果:被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性.通常终点底物1/6Kmapp而起始底物足够高，此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20％而V

4、mapp精度更高.用积分法所得Kmapp与双倒数法一致，且和黄嘌呤浓度成正比，对应Ki为(5.4±0.8)μmol/L(n=3)，也与双倒数法一致.结论:被分析数据精度足够高，用无抑制剂时米氏常数（MichaelisMentenconstant,Km）4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度1/6Km，此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.【关键词】积分法；双倒数分析法；尿酸酶；黄嘌呤；米氏常数；抑制常数0引言酶抑制剂是新药开发热点.通常据表观米氏常数（apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp）和表观最大反应速度（apparentmax

5、imalreactionrate,Vmapp）随抑制剂浓度变化同步确定抑制类型和抑制常数（inhibitionconstant,.freelapp和Vmapp筛选抑制剂需要底物浓度分布在米氏常数(MichaelisMentenconstant,Km)两侧.freel和最大反应速度(maximalreactionrate,Vm).经典积分法所用积分速度方程自变量缺乏统计合理性，所得参数可靠性低［2］.最近发现用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，能可靠测定酶动力学参数并筛选抑制剂［3-7］.此积分法筛选抑制剂对初始底物浓度误差不敏感，且效率高而成本低.我们用

6、此积分法考察黄嘌呤对Candidaspecies尿酸酶的抑制作用，以期进一步明确此法筛选抑制剂的可靠性和应用条件.1材料和方法1.1材料尿酸、黄嘌呤购自I,Candidaspecies尿酸酶(E.C1.7.3.3)购自Sigma［U0880］.其余试剂为国产分析纯.1.2方法缓冲液含100μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］.反应体系含1.0mL缓冲液，底物、抑制剂和酶液共0.20mL.用双倒数法分析时，酶为0.083μkat/L，记录反应延迟30s后反应1min内的数据.积分法分析时，酶为0.333μkat/L，初始底物浓度为55μmol/L，在(25±0.5)

7、℃以10s间隔记录启动反应40s后底物消耗到1/8Kmapp(双倒数法测定)的反应曲线.用线性回归确定双倒数法所得参数.积分法测定参数按以前方法分析启动反应40s后光吸收变化0.001的6个以上数据［7］.用VisualBasic6.0编写程序，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指定文件.线性回归分析Kmapp及1/Vmapp随抑制剂浓度的变化确定对应的抑制常数.根据两种抑制常数的统计有效性和相对大小确定抑制类型［8］.统计学处理：结果用x±s表示，用SAS8.2分折数据，P0.05为有统计学差异.2结果双倒数法分析无抑制剂时9～70μm