在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性

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1、在高于米氏常数的底物浓度下用积分法测定尿酸酶活性：廖飞,朱小云,王咏梅,曾昭淳,左渝萍【关键词】尿酸酶　　【Abstract】AIM:TotestthereliabilityoftheintegratedmethodfortheassayofenzymeactivityatsubstrateconcentrationabovetheMichaelisMentenconstant(Km).METHODS:Uricasereactioncurveonitoredbyabsorbanceat293nm,anditeforirreversible,singlesubstratereactionete

2、rasapresetconstant.RESULTS:Vmol/L,thereongVmatinitialsubstrateconcentrationsfrom10to70μmol/L.Thereandinitialratestotheamountofuricaseol/Liftheresidualsubstrateol/L.TheloitsofVmbythisintegratedmethodshoitofVmorepronouncedatloethodeasthepredictorvariableintheintegratedrateequationisreliableforenzymea

3、ctivityassayatsubstrateconcentrationabovetheKm.　　【Keyit;substrateconcentration;enzymeactivityassay　　【摘要】目的:以尿酸酶为模型，考察在底物浓度高于酶米氏常数(Km)时用积分法测定酶活性(Vm)的可靠性.方法:用293nm光吸收记录尿酸酶反应曲线.用以反应时间为自变量的积分速度方程，以尿酸酶Km为常数而本底为非线性参数拟合尿酸酶反应曲线，搜寻对应最好拟合的Vm.结果:此积分法测定Vm主要受剩余底物浓度影响，本底基本没有干扰.剩余底物低于2.5μmol/L时用10~70μmol/L起始底物所得V

4、m无差异.用25和70μmol/L起始底物浓度时初速度和Vm都与酶量呈正比.在此两种底物浓度下积分法的下限相同，且与初速度法下限无明显差异.但用积分法测定酶活性的上限明显高于初速度法，而且起始底物浓度越低则差异越显著.结论:在积分法中使用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，在高于Km的底物浓度下能可靠测定酶活性.　　【关键词】积分法；初速度；尿酸酶；自变量；上限；底物浓度；酶活性测定　　0引言　　底物浓度受成本、溶解度或仪器直接测定底物的范围限制时，测定酶反应初速度上限通常很低.用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，可用很低浓度底物测定最大反应速度(Vm)，而且上限很

5、高［1-4］.此积分法可用于单底物和双底物酶［3］，还可用于筛选酶抑制剂［4］.理论上此积分法所测定Vm应和底物浓度无关［2］.但当底物浓度高于芳香酯酶酶米氏常数(Km)的25％［2］，或高于谷胱甘肽S转硫酶表观Km一半［3］，积分法所得Vm随底物浓度升高而逐步降低.当酶Km很低且定量灵敏度很低时，积分法需要较高底物浓度才能获得足够数据用于曲线拟合.但在较高底物浓度下此积分法是否可靠还未确定.尿酸酶反应曲线容易测定，动力学过程简单［5］.我们用纯化的candidautilis尿酸酶为模型，考察在高于酶Km的底物浓度下用积分法测定酶活性的可靠性.　　1材料和方法　　1.1材料　　尿酸和cand

6、idautilis尿酸酶(EC1.7.3.3)购自I,candidaspecies尿酸酶购自Sigma.其余试剂为分析纯.　　1.2方法　　1.2.1反应曲线记录缓冲液为50mmol/L硼酸钠（pH9.2,含50mol/L铁离子络合剂二乙基三氨基五乙酸）［5,6］.测定体系含1.0mL缓冲液，及适量底物和酶液共1.20mL.用ShimadzuUV265在(25±1)℃记录启动反应30s后的吸收变化曲线，间隔为10s，直到光吸收变化降低到刚开始阶段的10％以下.初速度为从对应起点开始反应半分钟的平均速度.　　1.2.2测定Vm取尿酸在293nm的消光系数(ε)为11.5(mmol/L)-1&#

7、12539;cm-1.对于存在恒定本底的反应体系，任意反应时刻(ti)的吸收(Ai)同尿酸浓度(Si)关系为Eq(1).　　Ai=ε×Si+Ab(1)设初始尿酸浓度为S0,将其单底物不可逆反应速度方程积分得Eq(2)［1-3,7-9］.ln(S0/Si)+(S0-Si)/Km=(Vm/Km)×ti(2)以启动反应40s的数据点(ts,As,0)为起点（其吸收A0,s为起点吸收而反应时间为零，即t’i=ti-t