实验一：米氏常数的测定

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1、实验一：米氏常数的测定生化分析实验一实验日期：年月日双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级姓名合作者教师评定【实验冃的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis和Menten运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：v?Vmax??S?式中：v为反应初速率（微摩尔浓度变化/min）；Vmax为最大反应速率（微摩Km?S尔浓度变化/min）；?S?为底物浓度（mol/L）；K

2、m为米氏常数（mol/L）o这个方程式表明当已知Km及Vmax时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同酶的Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km越大表明亲和力越小；Km越小表明亲和力越大。大多数纯酶的Km值在0.01?100mmol/Lo通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：lKmllllll????以对

3、作图得一直线，该直线与横轴截距？。vVmaxSVmaxSKmvS过氧化物酶是一种对氢受体（H2O2）底物有特异性,对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定,也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与牛命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆笛醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的，因此也称为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）OH

4、RP属于含HlL红素蛋白的一种，是由辅基氯化血红素（铁吓卩林）和脱辅基蛋白（糖蛋白）组成，分子量为44000oHRP是双底物酶（过氧化氢+多元酚或胺类底物），为求其对某一底物的Km,通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量，即可把该酶促反应当作单底物反应來处理。本实验我们选用3355'■四甲基联苯胺（TMB）作为氢受体，它可被Hb催化过氧化氢氧化生成有色产物，该产物在反应条件下（pH5-7左右）为蓝色物质（?max=650nm）o实验中我们使TMB的浓度大过量，测定HRP对H2O2的Km值（

5、反之亦可测定HRP对TMB的Km值）。【实验仪器及试剂】仪器：日立UV-3010紫外可见分光光度计；石英比色血（lcm）：2只；100?L微量取样器1支（枪头若干）；lmL取液器一支；电磁搅拌器1台（lcm聚四氟乙烯搅拌子1个）试剂：过氧化物酶（HRP溶液：mol/L；33,5,5'■四甲基联苯胺溶液（TMB）：mol/L（DMSO溶液）;H2O2溶液：mol/L；磷酸缓冲液（PBS）：pH=；mol/L1生化分析实验一实验日期：年月日【实验步骤】在1cm的比色皿（内置搅拌子）中加入1.7mLPBS,

6、然后在搅拌下,依次加入1OO?LHRP>TMB和不同量的H2O2溶液，马上移入样品架，记录650nm处吸收峰强度随时间变化的曲线。（参比：1.7mLPBS+100?LHRP+100?LTMB）【数据记录与处理】温度：【注意事项】H2O2应该配置成不同浓度，加入相同体积为佳，但是由于动力学测定本身误差较大，且H2O2本身体积所占比例不大，故采取上述步骤。【思考题】1.可查阅天然的过氧化物酶对H2O2的Km并与测定值进行比较2.初速率的测定应注意什么问题？本实验中初速率的单位为A（吸光度）/s（秒）与米氏

7、方程中的单位并不相同，为什么不影响km的测定？如需测定Vmax,应如何进行？