14 生物化学实验--酵母蔗糖酶米氏常数的测定

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1、酵母蔗糖酶米氏常数的测定【目的】1．掌握蔗糖酶米氏常数测定的方法及原理。2．熟悉蔗糖酶米氏常数测定的及意义。3．验证底物浓度对酶促反应速度的影响。【原理】当环境温度、pH和酶浓度等条件一定时，酶促反应的初速度（V）随底物浓度[S]增高而加快，直至达到一个极限，即最大反应速度（Vmax）。依据底物浓度与酶促反应初速度的这种关系，米–曼（Michaelis-Menten）氏推倒出如下公式，称为米–曼氏方程式（式3-1）。方程式中Km称为米氏常数，Km是酶的特征性常数，等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，Km可以近似地表示酶与底物亲合力的大小，Km愈小，表明酶

2、与底物的亲合力愈大。测定Km是研究酶促反应动力学的一种主要方法。林–贝（Lineweaver-Burk）氏将米–曼氏方程式等号两边取倒数得到的双倒数方程为林–贝氏方程式（式3-2）。实验选择不同的[S]，测定相对应的V，以1/V对1/[S]作图，得到一个斜率为Km/Vmax的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴上截距即﹣1/Km（图3-7），由此求出Km。V=（式3-1）=?+（式3-2）斜率：Km/VmaxY轴截距：1/VmaxX轴截距：﹣1/Km　　　　　　　　　　　　　　　　　图3-7双倒数作图法本实验以酵母蔗糖酶为例。应用制备的酵母蔗糖酶，在pH5.0的醋酸

3、缓冲液中，30℃条件下测定其Km值。其过程是：当酵母蔗糖酶在有缓冲液存在时与不同浓度的蔗糖混合，保持反应液的温度30℃，反应5min后，测定还原糖生成量（还原糖的定量测定，参见第3篇实验18）。以还原糖的生成量代表反应开始阶段的初速度(V)，按照Lineweaver–Burk作图法求得Km值。【器材】1．中号试管2．刻度吸量管3．微量移液器4．恒温水浴箱5．冷冻离心机6．分光光度计【试剂】1．0.2MpH5.0醋酸缓冲液0.2M醋酸30ml与0.2M醋酸钠70ml混合2．醋酸钠3．1M醋酸4．0.03M蔗糖溶液(1)蔗糖的纯化：在做实验前,用Bendiet氏试剂检

4、验蔗糖中是否有还原糖存在，如果有还原糖则需要将蔗糖纯化，纯化利用蔗糖和还原糖在乙醇中溶解度的差异(表3-7)，蔗糖在绝对量上最多，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。表3-7不同糖类在水和乙醇中的溶解度糖类水中的溶解度乙醇中的溶解度蔗糖果糖葡萄糖179＞200830.96.711.94纯化操作：称取干燥的蔗糖50g，置于250ml烧杯中，加入95%乙醇100ml，不时搅动，放置片刻后用布氏漏斗吸滤，沉淀用50ml95%乙醇淋洗2-3次。吸干沉淀，取少量用Bendiet氏试剂检验，应不具还原性；其余部分取出推置玻璃板上，80℃烘箱干燥后备用。(2)精确称取纯化的蔗糖10.2

5、6g，蒸馏水溶解，定容至1000ml。5．蔗糖酶溶液(1)自溶称取40g的干酵母粉放在250ml三角瓶中，再分别放入1.2g醋酸钠细粉末、30ml甲苯，充分搅拌使酵母液化，然后在35℃水浴中间隔片刻震荡、保温30分钟，此时会观察到菌体自溶现象。(2)粗酶的制备往上述自溶液中加入100ml水，充分搅拌，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于10,000r/min，4℃，离心10min。取出离心管后分三层，用吸液管将最上层的甲苯吸去，然后可再用一药勺挡住中间块状粘稠物，倾斜离心管倒出下层清夜。弃去粘稠物。此时会有一些悬浮物存在。再离心一次（10,000r/min，4℃，

6、离心10min），滤清上清液，小心倒入250ml烧杯中，得到的溶液为无细胞抽提液即粗酶液，用1M醋酸调节pH5.0左右。4℃保存备用。(3)蔗糖酶活性的预实验在进行具体实验之前，通过预实验调节酶活性(即酶的浓度)，使本实验中最高底物浓度，在规定的实验条件下所测得的吸光度值控制在0.8左右，这样能达到比较满意的效果。6．碱性铜试剂、标准葡萄糖溶液(0.025mg/ml）、磷钼酸试剂参见第3篇实验18。【操作】1．制备酶反应液取中号试管5支，编号，按照下表操作。试剂（ml）0管1管2管3管4管0.03M蔗糖液01.01.52.55.0去离子水5.04.03.52.50

7、pH5.0醋酸缓冲液0.50.50.50.50.5混匀，同时将蔗糖酶溶液一起置于30℃恒温水浴中，保温5min，使温度达到平衡蔗糖酶0.50.50.50.50.5充分混匀，置于30℃恒温水浴中，准确保温5min。碱性铜试剂1.01.01.01.01.0混匀，终止酶促反应。酶反应液留作还原糖的测定。2．还原糖的测定取中号试管6支，编号，按照下表操作。试剂（ml）0管1管2管3管4管5管酶反应液0.50.50.50.50.50去离子水1.51.51.51.51.50碱性铜试剂2.02.02.02.02.02.0葡萄糖标准液000002.0混匀,沸水浴中加热8min，取

8、出后勿摇动