淀粉酶米氏常数测定(1)

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1、淀粉酶米氏常数的测定生物化学实验之八安徽师范大学生科院生化教研室一、实验目的了解并掌握米氏常数的意义和测定方法二、实验原理酶促反应v-[S]曲线推导出米氏方程为：米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/[S]作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm，

2、斜率为Km/Vm。通过Lineweaver-Burk作图法作图后可方便的求出Km值。试管移液抢秒表吸耳球恒温水浴锅7200型分光光度计。三仪器和试剂三仪器和试剂试剂（1）酶液：精确称取酶制剂0.1g(以大约2000U／g计)，先用少量40℃蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用（2）原碘液称取碘11g，碘化钾(KI)22g，先用少量蒸馏水使碘-碘化钾完全溶解，定容至500mL，贮于棕色瓶内。（3）稀碘液取原碘

3、液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL．贮于棕色瓶内。（4）4％可溶性淀粉精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL，加热煮沸至透明，冷却后定容至100mL,此溶液现配现用。（5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)45．23g和柠檬酸(C6H8O7·H2O)8.07g，用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸校正pH，定容至1000mI。（6）0.2moL/LHCl取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86m

4、l加入已加有少量蒸馏水的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。四、实验操作1.淀粉浓度梯度吸光度不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏水0.25ml，充分摇匀，60℃放置10min，立即加入3.0ml的0.2moL/LHCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表1操作）瓶号试剂1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O

5、(ml)3.532.521.51缓冲液(ml)0.750.750.750.750.750.75蒸馏水(ml)0.250.250.250.250.250.25充分摇匀，60℃放置10min加入3.0ml的0.2moL/LHCl，摇匀取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液显色A660不同底物(可溶性淀粉)浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）可溶性淀粉4mL，缓冲液0.75mL，摇匀后，在60℃水浴中平衡5min，加入0.25mL稀释好的酶液，立即记时，充分摇匀，准确反应10min，立即

6、加入3.0ml的0.2moL/LHCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液显色，摇匀，并以稀碘液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表2操作）。2.Km测定瓶号试剂1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51缓冲液(ml)0.750.750.750.750.750.7560℃放置，预热5min酶液(ml)0.250.250.250.250.250.25充分摇匀，60℃放置10min取出，加入3.0ml的0.2moL/LHCl取出1.0

7、ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色A660可溶性淀粉量浓度%0.51.01.52.02.53.0[s]1/[s]v1/v酶的反应速度V：以单位时间内吸光度的减少量d(A0-A1)／dt来表示以1/v对1/[S]双倒数法作图计算Km值。3.数据处理与作图五、实验注意事项取液量一定要准确。反应时间一定要精确。加酶前后一定要将试剂混匀。分光光度计的正确使用。取液器的使用六、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？