过氧化氢酶米氏常数的测定

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1、生化实验过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐1211400122013/11/28过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐121140012一、实验目的1.了解米氏常数的测定方法2.学习提取生物组织中的酶二、实验原理1.米氏反应动力学米氏方程(Michaelis-MentenEquation):2.米氏常数的意义：①反映酶的种类：Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关，与酶浓度、底物浓度无关。②米氏常数是酶促反应达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度。其数值大小反映了酶与底物之间的亲和力：Km值越大，亲和力越弱，反之Km值越小，亲和能力越强。③Km可用来判断酶（多功能酶）的最适底

2、物：Km值最小的酶促反应对应底物就是该酶的最适底物。3.米氏常数的求法：该方法的缺点是难以确定最大反应速度Vmax。生化实验过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐1211400122013/11/28该作图法应用最广。但在低浓度是v值误差较大，在[S]等差值实验时作图点较集中于纵轴。因此在设计底物浓度时，最好将1/[S]配成等差数列，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归法，就可以得到较为准确的结果。此法优点是横轴上点分布均匀，缺点是1/v会放大误差，同时对底物浓度的选择有要求。[S]<>Km时直线将在原点附近与轴相交。4.氧化酶：生物体内

3、重要的三种氧化酶类，其作用均是消除体内自由基：①POD：过氧化物酶②SOD:超氧化物歧化酶③CAT：；过氧化氢酶5.过氧化氢酶的作用：植物体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发生积累。过氧化氢可进行一步生成氢氧自由基。氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶（catalase，CAT）可以清除过氧化氢、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。

4、6.过氧化氢酶活力的测定方法：生化实验过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐1211400122013/11/28①紫外吸收法：过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240nm）随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。（以一分钟内A240nm下降0.1为一个单位）②滴定法（高锰酸钾法、碘量法）在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。根据单位时间内消耗的过氧化氢的量即可测出过氧化氢酶活力大小。7.实验中的反应：H2O2被过氧化

5、氢酶分解出H2O和O2,未分解的H2O2用KMnO4在酸性环境中滴定,根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:酶2H2O2−→2H2O+O22KMnO4+5H2O2+3H2SO4−→2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2（本实验以马铃薯提供过氧化氢酶）三、实验试剂1.0.02mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.0):实验室提供.2.酶液:称取马铃薯5g,加缓冲液10mL,匀浆过滤.3.0.01mol/L高锰酸钾.4.0.098mol/LH2O2.5.25%H2SO4.四、实验操作取6只锥形瓶,按下表的顺序加入试剂.先加好过氧化氢和蒸馏水,加酶液后立即混合,依次记录各

6、瓶的起始反应时间.反映到达5min立即加入2ml25%硫酸终止反应,充分混匀.。用0.01mol/L的KMnO4溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色,记录消耗的高锰酸钾体积.。生化实验过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐1211400122013/11/28五、注意事项：1.反应时间必须准确。2.酶浓度须均一，若酶活力过大，应适当稀释。3.滴定终点的判定。六、实验结果：过氧化氢浓度：0.098mol/L称取马铃薯的质量：5.00g高锰酸钾：0.01mol/L序号1345V（KMnO4）/ml2.74.46.3212.4[S]/(mol/L)0.00980.0163680.0

7、2450.049v/(mmol/min)0.00610.0107320.01740.0361/[S]102.040861.094840.816320.40821/v163.934493.179357.471327.7778生化实验过氧化氢酶米氏常数的测定傅璐1211400122013/11/28米氏常数Km=-0.1913七、实验结果分析：1.曲线上少一个点的原因：用移液管移取序号为2的过氧化氢溶液（应为1.25ml）错误的移取了1.75ml，故在制图时将其舍去。2.曲线线性较好（R²=0.9988）的原因：本实验采取了两人分工的方法完成实验，控制反应结束及滴定分

8、别由一人完