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《碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位
2、数。*每毫升样品中的蛋白质毫克数。3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2Vmax,Km=[S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。二.器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三.试剂1.0.5mol/L醋酸镁溶液
3、称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2.0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3.0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4.丙酮(分析纯).5.95%乙醇(分析纯).6.Tris缓冲液(Ph8.8)称取Tris6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/LTris液,取0.1mol/LTris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋
4、酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7.0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o)0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期;临用时与等量0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8.0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9.碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml
5、,混合后加蒸馏水至100ml.10.0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11.0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12.酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1).“碱性磷酸酶分离纯化”实验操作(2).“碱性磷酸酶比活性测定”实验操作1.样品中碱性磷酸酶活性测定:(1).取5支试管,编号,按表1操作:表1A’B’C’D’标准空白各阶段稀释液(ml)0.10.10.10.1--0.1m
6、g/ml酚标准液(ml)----0.1-pH8.8Tris缓冲液(ml)-----0.1置37℃水浴中保温5分钟复合基质液(ml)3.03.03.03.03.03.0混匀,37℃水浴中准确保温15分钟.保温结束后,各管立即加入1.0ml碱性溶液终止反应,再加入0.5%铁氰化物钾2.0ml,立即混匀,静置10min,在510nm波长下比色测定.2.酶活性单位计算每毫升酶液中酶活性单位=测定OD/标准ODX标准管中酚含量X1/0.1X稀释倍数3.样品中蛋白质含量的测定(1)测定蛋白质时,保留的A’管还需稀释5倍为A’’管,否则蛋白质浓度太高,其
7、余各管不需再稀释,各用1.0ml进行测定.表2A’’B’C’D’空白各阶段稀释液(ml)1.01.01.01.0-0.1mg/ml酚标准液(ml)----1.0pH8.8Tris缓冲液(ml)5.05.05.05.05.0混匀,置20~25℃水浴中保温10分钟复合基质液(ml)0.50.50.50.50.5(2)立即振摇均匀,在20~25℃保温30min后,于650nm波长处比色.(3)蛋白质浓度计算:从Lowry法标准曲线查得的蛋白质毫克数,乘以稀释倍数,即为每毫升样品中蛋白质毫克数.4.比活性及得率计算碱性磷酸酶比活性=每毫升样品中碱性
8、磷酸酶活性单位数/每毫升样品中蛋白质毫克数纯化倍数=各阶段比活性数/匀浆(A液)比活性数得率=各阶段酶的总活性单位/匀浆(A液)中的酶的总活性单位X100%5.实验结果将上述各实
