毛细管电泳法检测肺癌p53基因第七外显子的突变论文

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1、毛细管电泳法检测肺癌p53基因第七外显子的突变论文刘勇王荣高岚贾正平辛晓婷谢华马骏【摘要】p53基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用，检测基因点突变的方法学研究将有助于临床准确诊断肺癌。本实验用PCR扩增包含249位密码子的肺癌及癌旁正常组织p53基因第七外显子，扩增样品分别经96℃变性和HaeⅢ酶切处理，以CESSCP、CERFLP、PAGESSCP和PAGERFLP对其突变情况进行检测，并从上样量、时间、检出限和检出率4个方面进行比较。PAGE凝胶浓度为15%;CE筛分介质PEO浓度3.0%，pH8.2，电压15kV，温度15℃.freel，λem=520nm荧光检测

2、。检出率由高到低分别为：CESSCPPAGESSCPCERFLPPAGERFLP。CESSCP可作为大规模肺癌早期诊断的简便可靠的方法。【关键词】肺癌，基因突变，毛细管电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，单链构象多态性，限制性片段长度多态性1引言p53基因是一个具有独特作用的抑癌基因,突变后具有癌基因作用，一直是癌症研究的热点1，是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，其第七外显子是突变的集中区域，237～249氨基酸位置的基因编码区是一个高度保守区密切相关的热点区2。通过对肺癌相关基因的研究，将有助于肺癌早期诊断和治疗方案的制定，降低死亡率，促进其它癌症诊断方法学的研究。常用

3、检测基因突变的方法有：单链构象多态性(SSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、DNA芯片技术、DNA测序等，其中SSCP和RFLP使用最为广泛。这些方法大多与聚合酶链式反应(PCR)相结合，检测手段依赖平板凝胶电泳，在准确性、灵敏度、检测成本及时间等方面存在不足3,4。近年来，越来越多的研究者将毛细管电泳(CE)用于检测基因突变的研究中。Mitchelson等5用CE对基因点突变进行了筛查;Felmlee等6研究了CE在临床诊断DNA方面的潜在作用;施维等7用自制线性聚丙烯酰胺凝胶电泳柱对寡聚核苷酸的分离进行了研究。

4、越来越多的研究表明，与其它检测技术相比，CE具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，在核苷酸分析方面具有独特的优越性。本实验采用SSCP、RFLP结合聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)以及CE对肺癌p53基因突变进行研究，并对这些方法进行了比较，为寻找科学准确的基因诊断方法提供依据。2实验部分2.1仪器与试剂P/ACESystem5000型毛细管电泳仪、P/ACESystem5000station数据处理软件、P/ACESystemlasermodule488nm激光发射器(美国Beckman公司);石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂)。聚环氧乙烷(PEO，Mr=300000);

5、限制性内切酶HaeⅢ(TaKaRa);丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS，国药集团化学试剂有限公司);γ甲基丙烯酰基三(甲氧基)硅烷(MAPS，AJohsonMatthey公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司);硼酸、乙二胺四乙酸二钠(EDTA，天津化学试剂厂);SYBRGreenⅠ核酸染料(厦门百维信公司);pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNAMarker(上海生物工程技术有限公司)。肺癌及癌旁正常组织各40例取自兰州军区兰州总医院病理科，所有标本均来自肺部切除并经病理切片证实。2.2组织DNA提取，引物设计及PCR扩增酚氯仿

6、法提取肺癌及癌旁正常组织基因组DNA。PP5.0软件设计p53基因第七外显子，包含249位密码子突变位点的引物，该位点突变后能引起限制性内切酶HaeⅢ酶切位点(GGCC)消失，引物由上海生物工程技术有限公司合成。上游：5′TATCTCCTAGGTTGGCTCTG3′，下游：5′TGACCTGGAGTCTTCCAGT3′，长度为124bp。PCR扩增条件：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环。2.3PAGESSCP检测扩增产物加入1/6体积上样缓冲液，96℃变性15min，冰浴5min，立即上样3μL，凝胶浓度为15%，125V电泳8h;凝胶作

7、常规AgNO3染色。2.4PAGERFLP检测酶切体系(30μL)：HaeⅢ5U、扩增产物9μL、三次蒸馏水18μL、缓冲液2μL。37℃水浴1h，升至80℃灭活20min。扩增产物经酶切后，以15%PAGE检测，样品中加入1/6体积上样缓冲液，125V电泳6h;常规AgNO3染色。2.5CESSCP和CERFLP检测