毛细管电泳方法快速检测肺癌组织p53基因第249 位密码子点突变研究

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1、http://www.paper.edu.cn毛细管电泳方法快速检测肺癌组织p53基因第249位密码子点突变研究121辛晓婷，王荣，刘勇1兰州大学生命科学学院，兰州（730000）2兰州军区兰州总医院药材科，兰州（730050）E-mail：rhea1001@163.com摘要：目的：p53基因点突变在肺癌的发生过程中起重要作用，检测基因点突变的方法学研究将有助于临床准确诊断肺癌。方法：运用毛细管电泳（CE）与聚丙烯酰胺电泳（PAGE）两种方法对肺癌及癌旁正常组织p53基因第249位密码子点突变进行检测，并对其检测结果进行比较。PAGE以15%聚丙烯酰胺作为分离胶；毛细管电泳分离条件为2

2、.0％甲基纤维素（MC）（pH＝8.0）筛分介质，分离温度25℃，电场强度200V/cm。结果：用毛细管电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法均能检测到p53基因第249位密码子点突变，而且毛细管电泳方法检测时间短，且检测率高。结论：毛细管电泳可为大规模进行肺癌的早期诊断提供简便可靠的方法。关键词：毛细管电泳；限制性片段长度多态性；p53基因；点突变中图分类号：Q5031．引言肺癌是世界上发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，随着对肺癌发病机理研究的深入，已发现肺癌的发生发展是一个多基因参与的多步骤的复杂过程，同时，在肺癌的发生发展过程中与基因突变有着紧密的联系，检测与肺癌相关基因的突变点，对于肺

3、癌早期诊断具有重要意义。据报道在肺癌的发生和发展过程中p53基因突变是主要的，其中p53基因的第249[1-6]位密码子是突变热点。而限制性片段长度多态性（RFLP）分析被用于检测的基因突变，当DNA序列的变异发生在限制性内切酶识别位点，或当DNA片段的插入、缺失或重复，使基因组DNA经限制性内切酶水解后发生片段长度改变时，均可使用此方法，常用的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺（PAGE）电泳进行限制性内切酶水解后发生片段长度，但是这些方法鉴别诊断无论在效率还是结果判断的准确性和灵敏度方面已不能满足临床的需要。[7-8]毛细管电泳（CE）在分离方面的高效、快速、灵敏度高具有特点已在分子生物学、[9

4、]分子医学和生命科学方面应用日益广泛，在DNA片段的分离和检测方面的应用尤为广泛。分离检测DNA片段时筛选良好的筛分介质是得到良好分离和提高检测灵敏度的关键，有研[10]究证明甲基纤维素（MC）是一种良好的筛分介质，因此本实验以MC为筛分介质，通过[11]优化CE过程中温度、电压、筛分介质MC浓度、pH值获得了最佳分离条件，本研究以此分离条件为基础检测了肺癌p53基因第249位密码子的突变，并将分离结果与聚丙烯酰胺电泳检测p53基因第249位密码子的突变结果进行对比，为检测基因突变点提供新的方法学。2．资料与方法2.1仪器P/ACESystem5000型毛细管电泳仪、P/ACESyste

5、m5000station数据处理软件、P/ACESystemlasermodule488nm激光发射器（美国Beckman公司）；石英毛细管柱（河北永年光1本课题得到国家自然基金面上项目（No.20775089）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn导纤维厂）；PCR扩增仪（ABI公司）;高速离心机（德国Heraeus公司）；真空干燥箱。2.2试剂丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）（国药集团化学试剂有限公司）；γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷（MAPS）（JohsonMatthey公司）；核酸染料SYBRGreenⅠ（厦门百维信公司）；Taq

6、DNA聚合酶、PCR试剂、HaeⅢ内切酶（TaKaRa）；pUC19DNA/MspⅠⅡ(Hpa)DNAMarker（MBIFermentas）。2.3研究对象肺癌及癌旁正常组织各38例取自兰州军区兰州总医院病理科，男32例，女8例，年龄33-75岁，平均年龄58.6岁，所有肺癌病例均经病理切片证实。2.4组织DNA提取，引物的设计及PCR扩增酚－氯仿法提取肺癌及癌旁正常组织基因组DNA。运用PP5.0软件设计PCR扩增引物，p53基因249位密码子点突变能引起HaeⅢ酶切位点（GGCC）的消失。扩增引物由上海生工合成：上游：5’-CCTGTGTTATCTCCTAGGTTGG-3’，下游：

7、5’-TCCAGTGTGATGATGGTGAG-3’，扩增片段长度为118bp。PCR扩增体系25µL扩增体系中含有：dNTP200µL、引物0.05µmol/L、TaqDNA聚合酶0.5U/µL、DNA模板20mg/L；PCR反应循环条件：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。PCR扩增产物均经聚丙烯酰胺凝胶电泳证实。2.5RFLP-PAGE方法检测PCR产物按照引物设计原则，PCR扩增产物经限制性酶