毛细管电泳法检测癌基因c-myc胃癌中基因点突变

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第11期2011年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1695~1700DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.01695毛细管电泳法检测癌基因C-myc胃癌中基因点突变1,2*1,2*1,21谢希晖王荣贾正平谢华3111张爱梅徐娟王晓莉王先华1(兰州军区兰州总医院临床药理基地,兰州730050)2(兰州大学药学院,兰州730000)3(西北师范大学生命科学院,兰州730070)摘要癌基因C-myc激

2、活和突变在胃癌形成过程中起着重要作用。通过毛细管电泳(CE)方法检测50例胃癌患者中C-myc基因突变,建立一种准确、快速诊断早期胃癌的方法。本实验采用PCR扩增胃癌及癌旁正常组织中C-myc基因第二外显子易发突变的部位基因序列,扩增样品分别经96e变性和EcoRⅤ酶切处理,以PAGE-SSCP,CE-SSCP,CE-RFLP分别对其突变情况进行检测。优化的CE检测条件:筛分介质PEO浓度3.0%,pH8.2,电压15kV,温度15e;荧光检测:Kex=488nm,Kem=520nm。检测结果:C-my

3、c基因总突变率为20.0%(10/50)。测序分析结果显示C-myc基因第二外显子第53密码子存在点突变,碱基A变为碱基T(GAT→GTT),碱基的改变使氨基酸由亮氨酸替代为谷氨酰胺。本研究数据证实C-myc基因突变与胃癌的形成紧密相关,CE检测C-myc突变基因可作为胃癌早期诊断的简便可靠的方法。关键词胃癌;C-myc;突变;毛细管电泳;单链构象多态性;限制性片段长度多态性1引言基因突变的检测在临床疾病诊断中起十分重要的作用。目前,筛查基因点突变常常采用以PCR为基础的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳等

4、常规实验方法,这些方法在满足临床快速检测基因突变的需要时有一定的局限性。毛细管电泳(CE)是一种新型的电泳分离分析技术,具有分离效率高、分析速度快、[1,2]样品用量少、应用范围广等特点,成为分离DNA片段的重要方法之一。CE与单链构象多态性(SS-CP)、限制性片段长度多态性(RFLP)等各种基因突变检测技术相结合时,显示了一定的优越性,并已成[3~9]功用于基因突变点的检测。尽管文献已有报道应用其它的方法对C-myc基因在胃癌中作用情况进行了研究,但是采用CE结合SSCP、RFLP检测胃癌中C-my

5、c基因突变点的文献未见报道。[10,11]胃癌在我国是消化道高发的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率居各种恶性肿瘤之首。胃癌的发生、发展涉及多种癌基因、抑癌基因及细胞周期调节基因变化的积累,以及基因的不稳定性等变化,其[12]中位于人类第8号染色体q24区带上的癌基因C-myc突变,与肿瘤发生有一定关系,检测其突变对于确定肿瘤病因判断预后等有重要意义。C-myc激活表现为基因突变和染色体异位。有研究认[13~15]为C-myc癌基因具有刺激细胞增殖和促进细胞凋亡的双重作用,其作用的选择是由其他信号,如生长因

6、子等因素的存在或其他存活刺激所决定。本实验中C-myc基因经PCR扩增,通过SSCP,RFLP结合CE分别对C-myc基因突变情况进行研究,进一步探讨C-myc基因突变和胃癌的关系,建立检测胃癌中C-myc基因突变方法,为科学准确的胃癌早期诊断奠定基础和提供依据。2实验部分2.1仪器与试剂P/ACESystem5000型毛细管电泳仪、P/ACESystem5000station数据处理软件、P/ACESys-temlasermodule488nm激光发射器(美国Beckman公司);石英毛细管柱(河北永

7、年光导纤维厂);PCR扩增仪(杭州晶格科学仪器有限公司)。2011-02-14收稿;2011-05-06接受本文系国家自然基金(No.20775089),甘肃省自然基金(No.ZS031-A25-70-E)和中国博士后基金(No.2005037576)资助项目*E-mail:wangrong-69@163.com1696分析化学第39卷聚环氧乙烷(PEO,Mw=300000);限制性内切酶EcoRⅤ(Fermentas);丙烯酰胺(Genview)、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)均购于国

8、药集团化学试剂有限公司;C-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)(AJohnsonMatthey公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris,北京鼎国生物技术有限公司);乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、硼酸(天津化学试剂厂);TaqDNA聚合酶、PCR试剂(BioBasicinc);SYBRGreenⅠ核酸染料(10000@,50mL/支,厦门百维信公司);pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNAMarker(BioBasicinc);100