ebv相关胃癌组织中ras基因突变的检测论文

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1、EBV相关胃癌组织中ras基因突变的检测论文孙佰秀刘薇张璐罗兵【摘要】目的探讨EBV感染、ras基因突变在EBV相关胃癌（EBVaGC）发生发展中的作用。方法应用PCRRFLP技术，分别检测13例EBVaGCs、45例与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnGC)以及58例相应癌旁组织中Hras12位点，Kras12、13位点突变情况。结果检测到2例Hras12位点突变，突变率为4.44%（2/58），均发生在EBVnGC组织。结论胃癌组织ras基因突变率较低，ras基因突变与EBVaGC的发生无明显相关性

2、。【关键词】胃肿瘤；疱疹病毒4型，人；基因，ras［ABSTRACT］ObjectiveToanalyzethepathogenicroleofEBVinfectionandrasmutationsinthedevelopmentofEBVassociatedgastriccarcinoma(EBVaGC).MethodsRasgenemutationsas(EBVnGC)atchedclinicopathologicalparametersand58correspondingadjacenttissues

3、ofthecancer.ResultsHras12codonmutationas(4.44%),utationsingastriccarcinomasisloutationisnotrelatedentofEBVaGC.［KEYgCl25mmol/L，dNTP1mmol/L，AMV反转录酶15U，核酸酶抑制剂0.5U，Oligo(dT)150.5μg，模板RNA5μL，加NucleaseFreegCl21.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，上下游引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0

4、U，DNA模板2μL，加双蒸水至终体积25μL。检测Kras12位点突变的PCR扩增参数为：95℃预变性5min；95℃40s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。检测Kras13位点突变的扩增参数中退火温度调整为50℃，其余参数均与检测Kras12位点突变相同。检测Hras12位点突变的PCR扩增参数为：94℃预变性5min；然后，94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃延伸5min。取PCR扩增产物5μL于含溴化乙锭（0.5mg/L）的20g/

5、L琼脂糖凝胶中电泳（80V，1h），紫外线投射仪下观察结果，并与PCRMarkerDL2000进行对照分析，若分别观察到162、159和170bp条带表明扩增成功。1.3.3限制性酶切反应检测Kras12位点突变的限制性酶切反应体系为：10×NEBbuffer2μL，100×BSA0.2μL，BstNⅠ5U，PCR产物10μL，最后加双蒸水至20μL，混匀后60℃水浴过夜。检测Kras13位点突变的限制性酶切反应体系为：10×buffer2μL，HaeⅢ5U，PCR产物5μL，最后加双蒸水至20μL，混匀

6、后37℃水浴过夜。检测Hras12位点突变的限制性酶切反应体系为：10×buffer2μL，HpaⅡ10U，PCR产物5μL，加入双蒸水至20μL，混匀后37℃水浴1h。酶切产物于80g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外线投射仪下观察结果并拍照。野生型和突变型条带结果判断标准见表1。表1PCRRFLP检测所用寡聚核苷酸引物和限制性核酸内切酶名称引物序列（略）2结果本文2例病人检测到Hras12位点突变，突变率4.44%（2/58），均发生在EBVnGC（图1～3）。Kras12位点PCR产物

7、大小为162bp，野生型酶切产物大小为133、29bp；Kras13位点PCR产物大小为162bp，野生型酶切产物大小分别为85、48及26bp；Hras12位点PCR产物大小为170bp，野生型酶切产物大小为66、56及48bp,突变型酶切产物大小为122、48bp。3讨论EBV是疱疹病毒科γ亚科的淋巴滤泡病毒，大量血清学研究表明，EBV感染十分广泛，几乎遍及世界各地，成年人的感染率可达98%。EBV具有B淋巴细胞嗜性，能够在B淋巴细胞中建立潜伏感染，并可刺激细胞增生和转化。EBV引起的人类疾病主要包括

8、传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤，并与多种恶性肿瘤的发生密切相关。1993年，TOKUNAGA等4将经EBER1ISH证实存在EBV的胃癌细胞定义为EBVaGC。ras基因家族包括Haras、Kiras和Nras，编码产物Ras蛋白有两种结合形式：一种为与GTP结合的活性形式；另一种为与GDP结合的非活性形式。Ras蛋白两种形式的转换可调节细胞生理功能并参与信号传导。在正常细胞中，Ras蛋