喉癌切缘p53基因突变的研究

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1、摘要前言K(目前喉癌的治疗方法主要是手术治疗，其根本目的在于彻底切除肿瘤组织并在此基础上进行喉功能重建，但喉癌术后局部复发率仍有15％，手术切缘的洁净程度是影响喉癌术后局部复发的主要原因，其中原因有目前常规病理检查技术不能完全检测到切缘的少量癌细胞及细胞表面形态正常而细胞内部基因发生改变可发展成为癌的细胞寸。肿瘤抑制基因p53突变是人类恶性肿瘤最常见的遗传学改变，在肿瘤中具有较高突变率。本文应用聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR．SSCP)法检测声门上型喉癌手术切除标本不同切缘部位的p53基因突变情况，分析预测喉癌术后局部复发情况，确定诊断喉癌切缘的异常分子

2、边界。实验材料，?41．实验材料：取自中国医科大学第一临床学院耳鼻喉科1998．2000年问56例声门上型喉癌患者手术切除标本，病理为喉鳞状上皮细胞癌，临床资料完整。其中男45例，女11例，年龄41—72岁，平均62岁，术前未经放疗、化疗。按1997年UICC分期标准分期：T17例，T224例，T315例，L10例。所有喉标本切除后检查记录喉内病变，距肿瘤边缘向外各方向(上、下、左、右)切取O．5cITl宽条形组织至切缘，石蜡包埋，行连续切片。分别于肿瘤边缘(0删)、2mm、5咖、10mm处各取1张5um切片HE检查、20张12um用于PCR检查。将全部标本的最短

3、切缘距离按0删～、2咖～、5舢～、10哪～分为四组，检测部位切缘常规病理检测无癌细胞残留，取喉正常组织作对照。2．试剂来源：试剂盒来自T酞ara公司，引物由北京奥科生物有限公司合成，分别扩增p53基因外显子5．8。引物序列：P5A：11ACTCCCCTGCCCTCAACA，P5B：CATCGCllATCTGAGCAGCGC，183bp；P6A：GTCTGGCCCCTCCTCAGCAT，P6B：CTCAGGCGGCTCATAGGGCA，113bp；P7A：GTTGGCTCTGACTGTACCAC，P7B：CTGGAGTCTTCCAGTGTGAT，110bp；P8A：

4、TGGTAArCTACTGGGACGG，P8B：CTCGCTTAGTGCTCCCTGG，137bp．实验方法1．用常规酚氯仿法提取组织DNA。2PCR扩增和PCR-SSCP按说明书进行。3．结果判定：根据切缘样品PcR产物单链带泳动位置与正常对照的差异来判断样品中是否有突变；野生型p53的单链DNA位于同一水平上，突变型p53的单链DNA高于或低于野生型p53单链DNA的不同水平上。4．临床研究：所有喉癌患者术后定期复诊随访，行问接喉镜和纤维喉镜检查，了解喉内情况有无局部复发，观察切缘p53基因突变情况与喉癌术后局部切缘复发的关系。5．统计学检查：x2检验，P<0

5、．05为差异性显著。实验结果1．喉癌切缘组织p53基因的突变表达情况喉癌切缘组织p53基因突变率为21．4％(12／56)，喉正常组织中无p53基因突变表达。2．切缘p53基因突变与局部复发的关系喉癌切缘p53基因突变局部复发率为58．3％(7门2)，而切缘无p53基因突变者无一例局部复发。3．不同切缘距离与局部复发的关系经检验0咖～组与2哪～组之间，5姗～组与10姗～组之间局部复发率差异无显著性：0咖～组、5舢～组之间局部复发率差异有显著性，将切缘定于5栅，0删～、2咖～为阳性切缘，5咖～、10姗～为阴性切缘。4．切缘口53基因突变与预后关系病人术后随访3年，切

6、缘阳性组死亡6例，阴性组死亡3例，Log_ralll(检验切缘阴性组生存率高于阳性组(p<0．01)。5．切缘p53基因突变与临床分期和病理关系喉癌切缘p53突变率淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，临床T3、T4高于T1、T：，病理低分化高于高、中分化，差异具有显著性意义(p<0．05)。讨论喉癌手术治疗的目的是切除原发肿瘤组织，肿瘤组织残留具有较高局部复发率，手术切缘是否阴性的准确报告非常重要，假阳性将导致过大切除，喉功能损伤重；假阴性则导致术后局部复发，因此，确切了解喉癌手术切除范围至关重要。喉癌手术切缘是指切缘至肿瘤的最短安全距离，切缘的洁净程度直接影响患者术

7、后局部复发，切缘阳性病人术后局部复发率可达75％一80％。目前，常规病理检查是确定喉癌手术切缘阳性与否的主要指标，常规病理检查阳性切缘检出率为9％，喉连续切片切缘阳性检出率为30％一35％。部分阴性切缘术后出现局部复发，除因需要能检测阳性切缘的癌细胞数量不足而不能辨别外，还有细胞形态正常而内部基因已发生改变细胞，，并最终发展成为复发癌组织。聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PcR—ssCP)可用于检测肿瘤细胞基因突变，具有高度特异性，灵敏性，可在细胞癌变早期发现病变细胞，准确评估界定喉癌切缘的分子边界，做到阳性切缘早期发现。现已发现多种肿瘤癌基因和抑癌基因在肿瘤发

8、病过程中的