用pcr┐sscp及dna测序法研究胃癌p53基因突变

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1、用PCR┐SSCP及DNA测序法研究胃癌p53基因突变　　Keyutation;stomachneoplasms;poly-merasechainreaction;silverstaining;sequenceanalysis，DNA　　Abstract:AIMToinvestigatetherelationshipbetutationofp53geneandhumangastriccancer.METHODSMutationsinexon4～7ofp53geneinedin25casesofgastriccancerbyPCRandPCR-S

2、SCP-Silverstain-ing.Inaddition，Sangermethod（dideoxy-mediatedchain-terminationmethod）ofDNAsequencinginetheexon7utation.RESULTSMutationsentdeletionof18bputation.CONCLUSIONThereisastrongcorrelationbetutationandhumangastriccancer.Moreover，themutationmaynotbeconfinedtopointmuta-t

3、iononly.Itcanbealargefragmentdeletion.　　0引言　　p53基因是一个广谱的抑癌基因［1，2］，大约50%的人类肿瘤与p53基因的突变、过量表达或杂合性丢失有关［3-9］.该基因全长16～20kb，包括11个外显子，第4到第8外显子是其突变的热点区域［7，10-12］.p53蛋白是一种Mr=53的磷酸核蛋白，野生型的p53基因对调节细胞分裂、诱导细胞的程序化死亡、抑制肿瘤细胞的生长有着重要的作用.突变后的p53基因则能促进细胞分裂和转化，从而导致肿瘤的发生.可见，它在肿瘤发生中起着一种负调控作用.胃癌是黄色人

4、种中高发肿瘤之一，我国胃癌发病率达5～40/10万，因此对胃癌的病因学探讨和研究，对于该肿瘤的预防和治疗，有着重要的理论意义和实践价值.我们应用PCR，PCR-SSCP（PCR-Singlestrandconformationpolymorphism）结合银染法和DNA序列分析技术，对南京地区25例胃癌患者手术切除标本进行了p53基因突变研究，首次发现在中国人胃癌中存在p53基因的大片段缺失，为胃癌的病因学提供了又一分子生物学依据.　　1材料和方法　　1.1标本采集和DNA制备胃癌组织及癌旁正常组织标本共25对，均取自手术切除标本，由南京铁道医

5、学院附属医院提供，并经病理科鉴定.手术切除后的标本立即置-80℃保存备用.所有标本采用常规酚氯仿法提取基因组DNA.　　1.2引物序列及PCR扩增　　1.2.1PCR引物的选择与合成选择p53基因突变热点第4，第5～6和第7外显子进行PCR及PCR-SSCP，其引物由上海细胞生物学研究所合成，引物序列见Tab1.　　表1PCR扩增所用的3对引物　略　　1.2.2PCR扩增体系10×PCRreactionbuffer5μL;5×dNTPs2μL;1对引物各1μL;模板DNA1.0μg;Taq酶1U;加H2O至50μL，加盖石蜡油.　　1.2.3P

6、CR反应循环参数第4外显子:预变性93℃3min;变性93℃45s;退火58℃45s;延伸72℃90s;循环28cycles;延伸72℃8min.第5～6外显子:预变性93℃3min;变性93℃45s;退火58℃45s;延伸72℃90s;循环30cycles;延伸72℃8min.第7外显子:预变93℃3min;变性93℃45s;退火60～61℃30s;延伸72℃60s;循环25cy-cles;延伸72℃5min.　　1.2.4PCR扩增产物检测取PCR扩增产物5μL，用于20g・L-1琼脂糖凝胶电泳，并以小分子质量marker作分

7、子质量标记，检测PCR扩增产物的长度及纯度.　　1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳①将玻璃板洗净干燥，选取适当的橡胶夹条，按要求装好电泳板;②配制60g・L-1凝胶:300g・L-1聚丙烯酰胺母液8mL;5×TBE4mL;甘油2mL;100g・L-1过硫酸铵400μL;蒸馏水25.5mL;TEMED40μL，混匀;③倒胶，插入加样梳，静置4～5h至胶凝结;④500V电压预电泳30min;⑤取PCR产物5μL，加5μL变性加样液，混匀;95℃变性5min，迅速置冰浴中骤冷，然后加样;⑥电泳.恒压550～600V，温

8、度18～20℃，电泳时间视PCR产物大小而定.　　1.4银染①电泳完毕后，将胶剥下，放入洁净的盆内，并切下一角作为标记;②固定液浸泡30min，以蒸馏