第3讲 pcr和dna测序

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1、PCR和DNA测序技术PolymeraseChainReaction(PCR，多聚酶链式反应)特异片断的体外扩增技术无细胞克隆技术(“freebacteria”cloningtechnique）常用PCR仪1993年至今：计算机技术使循环操作实现了程序化和自动化，简化了PCR操作程序，使之迅速得到推广。PCR技术是方法学上的一次革命，生物学及医学领域的一个里程碑，巨大的推动作用。发展历程1983年，由Cetus公司的KaryMullis建立http://www.karymullis.com/http://v.y

2、ouku.com/v_show/id_XMTU2NDg1MDQ0.html1985年，Saiki等在《science》上详细描述（人珠蛋白DNA）1988年耐热的TaqDNA聚合酶被发现和应用，把PCR推向了实用阶段，成为PCR发展史上又一里程碑1989年，美国专利局授予PCR技术专利；PCR技术被《science》杂志评选为伟大的技术发明；1989年为DNA聚合酶的分http://www.karymullis.com/子年1993年，Mullis获得诺贝尔化学奖。类似DNA在细胞内的复制过程:由一对引物介导,

3、通过温度调节，使双链DNA变成单链（变性）；单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物；在dNTPs存在下，DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（延伸）PCR循环：一个热变性-复性-延伸的过程。通常，20-30个循环之后，可获得大约106倍待扩增的DNA片段的拷贝。什么是PCR?DNA在细胞内的复制过程aDNA在细胞内的复制过程bDNA复制过程中,2条新生链都只能从5端向3端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成.DNA在细胞内的复制过程cDNA在细胞内的复制过程dDNA在细胞内的复制过

4、程e1.PCR的基本原理在离心管中进行的DNA合成扩增技术，模拟染色体的体内复制过程；与体内DNA复制的不同之处：◇耐热的Taq酶取代普通的DNA聚合酶◇用合成的DNA引物替代DNA引物◇温度的调节：变性、退火、延伸◇反复循环，可使DNA无限扩增PCR的第1个循环过程PCR的第1和2个循环过程PCRPCR的第3个循环过程PCR技术的使用PCR的标准反应程序：变性-复性-延伸1)DNA模板的解链（变性）90℃~95℃，30s理论上，在90℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下

5、，DNA的完整性仍能很好保存2)DNA单链与引物的退火（复性）55℃~65℃，30~45s引物与模板单链特异性结合（较高的温度）；不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率>>DNA自身复性几率）;引物的最佳退火温度Tm-5℃，引物的量引物的长度3)引物的延伸（新链DNA的合成）70℃~75℃，30~60s（<2kb)首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的，3’端没有固定的终止点，长短不一第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’

6、端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域引物本身也是新生DNA链的一部分(10kb----15min)4)循环次数的设定主要取决于最初靶分子的浓度如：3x105、1.5x104、1x103、50copy25~30、30~35、35~40、40~45cycle过多的循环次数会增加非特异性扩增和碱基错配数；平台效应：PCR反应后期，扩增产物并不成指数方式的增加；产生原因：dNTP与引物浓度降低

7、，酶对模板的比例相对降低，酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。2.标准体系：常选用20~100ul体系模板核酸（template

8、如：人基因组DNA0.1ug)扩增引物（primer一对,各0.25umol/L）TaqDNA聚合酶（2.5U）dNTP（四种：各200umol/L)标准缓冲液：10Xbuffer（KCl、Tris-HCl、MgCl2、BSA或明胶）无菌双蒸水或三蒸水石蜡油或矿物油:30-50ul（封闭、防止高温时液体的挥发）3.影响PCR反应的因素(最适条件）(1)模板：将要被复制的核酸片段DNA或