讲义-dna测序和诱变

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1、DNA测序和诱变DNA测序(1)Sanger的双脱氧链终止法。该技术的发展是与DNA电泳技术的发展分不开的。因为DNA电泳可以将大小只差一个核苷酸的DNA片段分开。DNA电泳类似于蛋白质电泳，分析短的DNA片段常使用聚丙烯酰胺作为凝胶的基质，分析长的DNA片段时使用的基质主要是琼脂糖。Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂，2ˊ,3ˊ-ddNTP与普通的dNTP不同之处在于前者的脱氧核糖的3ˊ位又少了个羟基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3ˊ羟基

2、形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。双脱氧核苷三磷酸互补链合成过程如果在DNA的合成反应中，除了加入4种正常的脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊddNTP，那么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中，分别加入4种不同的ddNTP，结果将生成4组核苷酸链，它们将分别（随机）终止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可

3、读出序列。SangerSequencingMethodSanger双脱氧测序方法示意图•测序凝胶是高分辨率凝胶，可根据大小分离单链（变性的）DNA片段•它可以把长度相差一个碱基的片段分离•通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳实现。7-20%的聚丙烯酰胺，7M尿素•尿素的作用：减少DNA的二级结构•电泳时温度：70℃，目的：减少DNA的二级结构•电泳过后，标记过的DNA条带可以通过放射自显影显示在大张的X射线胶片上，由此分辨出序列DNA自动测序•改进：荧光标记•四种双脱氧核苷酸标记上不同光谱的荧光基团•电泳时通过检测器检测出来•由

4、此诞生DNA自动测序仪AutomatedSequencing(1)Maxam-Gilbert化学修饰法1977年，美国哈佛大学的Maxam和Gilbert发展•以化学切割为基础•基本原理：用特殊的化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段然后用电泳分离片段的大小，放射自显影，读胶确定DNA序列。•与Sanger的测序方法相比，其优点：不需要进行体外酶催化反应，只要具有3`或者5`末端标记的DNA，不管是单链还是双链，均可以用此法进行测序分析序列数据。。改变基因—

5、定点诱变研究基因表达调控和蛋白质结构与功能的重要方法•寡核苷酸直接点突变•PCR方法介导的定点突变•盒式突变寡核苷酸直接点突变•将要进行突变的目标基因(或片段)克隆于M13噬菌体载体上•从重组的M13噬菌体制备单链DNA•在突变位点设计突变引物•DNA聚合酶、dNTP、引物等，延伸DNA链，新生链末端用T4连接酶连接•转染大肠杆菌•筛选•获得突变的双链DNAPCR方法介导的定点突变PCR方法介导的定点突变盒式突变又称为片段取代法要点：利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片段来

6、置换或取代目标基因上的一段DNA序列关键性问题：（1）在目标基因序列中要有适当的限制性内切酶识别位点，以保证用以取代天然序列的盒式突变序列能有效地插入（2）获得合适的突变DNA片段（PCR方法或者人工合成）应用：研究蛋白质结构与功能之间的关系：（1）产生嵌合蛋白（结构域替换）（2）产生突变家族，探究特定结构域或者特定结构区段的结构和功能随机突变(randommutagenesis)•确定和研究在蛋白质和核酸序列中在功能上有意义位点的有用方法•可以作为进行特异性位点突变的一个”先行官”产生随机突变的方法•利用化学试剂进

7、行的随机突变•酶法随机错误掺入突变法•利用PCR产生随机突变利用化学试剂进行的随机突变经常用的化学试剂有:亚硝酸(嘌呤—嘌呤,嘧啶—嘧啶的转换)亚硫酸盐(C—G,A—T)羟胺(C—G,A—T)肼弱酸利用PCR产生随机突变（常用）在PCR反应中,通过改变各种反应条件，如:四种dNTP的比率，在Taq酶的作用下，可以发生多种频率的错误掺入。