DNA测序原理和方法

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1、......DNA测序原理和方法DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABIPRISM310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】ABIPRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引

2、物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收

3、峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP6)和GeneScan胶(POP4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能

4、，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDyeMix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反应缓冲液等。2．pGEM-3Zf(+)双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。3．M13(-21)引物TGTAAAACGACG

5、GCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。6．灭菌去离子水或三蒸水。7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。8．3mol/L醋酸钠(pH5.2)称取40.8gNaAc·3H2O溶于70m

6、l蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。9．70%乙醇和无水乙醇。10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml3mol/LNaAc混匀，室温可保存1年。11．POP6测序胶ABI产品。12．模板抑制试剂(TSR)ABI产品。13．10×电泳缓冲液ABI产品。14．ABIPRISM参考材料......310型全自动DNA测序仪。15．2400型或9600型PCR仪。16．台式冷冻高速离心机。17．台式高速离心机或袖珍离心机。【操作步骤】1．PCR测序反应(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：所加试剂测定模板

7、管标准对照管BigDyeMix　　　　　1μl　　1μl待测的质粒DNA　　　　1μl　　－pGEM-3Zf(+)双链DNA　　　－1μl待测DNA的正向引物　　1μl　　－M13(-21)引物－1μl灭菌去离子水　2μl　　2μl总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10s，50℃5s，