酵母功能诊断法FASAY在肿瘤P53基因突变检测中的应用

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1、复旦大学硕士学位论文酵母功能诊断法（FASAY）在肿瘤p53基因突变检测中的应用姓名：戈万忠申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：霍克克20030528复旦大学硕士学位论文ABSTRACTThisthesisconsistsoftwoparts：1·Screeningthep53mutationsinhumantumorsbyusingtheyeastfunctionalassay(FASAY)Thedevelopmentofalifethreateningtumorisamultistepprocess，andthemutat

2、ionofp53tnnlorsuppressorgeneisidentifiedinalmosthalfofthehumantumors．Toscreenthep53mutationinhumantumors，weestablishedayeast-basedmethod，whichCOJ／assessthep53statusbythetranscriptionofADE2reportergeneinSaccharomycescerevisiae．Wedetectedthemutationofp53in1of19HCCsample

3、sand0of9braintumorsamplesbythismethod．Inaddition，Bysequencingthep53eDNA，wefindtwop53mutationsin157and249codonwhichbelongtothemutationhotspotinHCC，andthreeframshiflmutations(codon62，124，264)notreportedinHCC．Therelationshipsbetweenp53mutationandHCCCanhelpUStounderstandt

4、hediseasemechanism．Keywords：yeastfunctionalassay,HCC，p53mntaion2．ThepurificationofArp2／3complexinSaccharomycescerevisiaebytandemaffinitypurification(TAP)andMALDI-TOFThetandemaffinitypurification(TAP)methodisageneralprocedureofproteincomplexpurification，whichcanallowef

5、ficientandreliablerecoveryofproteinspresentatlowcellularlevelundernativeconditions．Withthedevelopmentoflnassspectrometry,ithasbecomeanimportantnewtoolforproteincomplexcharacterizationandproteomeexploration．First，wepurifiedtheArp2／3proteincomplexbythismethodinSaccharom

6、ycescerevisiae，secondlNweconstructedseveralyeaststrainsthatcontaintheTAPtag，thiswillhelpUStopurifytheseproteincomplexesinthefuture．Keywords：Tandemaffinitypurification(TAP)，MALDI·TOEArp2／3complex2复日大学硕士学{奇：论文第一部分酵母功能诊断法(FASAY)在肿瘤p53基因突变检测中的应用前言1．P53基因结构和功能1979年，Lane和Le

7、vine等在SV40(猿猴病毒1转化的细胞中发现一种分子量约为53KDa，和SV40太T抗原共沉淀的一种蛋白，根据其分子量大小命名为p53蛋白‘1，“。最初认为P53基因是癌基因，是一个细胞周期中正的调控因子；但后来对它的遗传学上和功能上研究证明野生型p53基因是一个肿瘤抑制基因‘”。人类的p53基因是一段20kb的DNA，定位于17号染色体的短臀上17p13．1(4)。这个基因由11个外显子组成，第一个外显子不编码蛋白，定位于离外显子2和11有8—10kb远的地方。人类的P53蛋白由393个氨基酸组成，包括四个主要的结构域幔6'

8、7)。在N端是转录澈活结构域(1—42AA)，中间部分是序列特异性的DNA结合结构域(102—292AA)，C端区包括一个寡聚化结构域(323—356AA)和一个调控结构域(363—393AA)，如图1-1。转录激活结构域N末端的42个氨基酸组成，