d半乳糖致衰老小鼠学习记忆行为改变及对海马神经发生的影响论文

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1、D半乳糖致衰老小鼠学习记忆行为改变及对海马神经发生的影响论文余资江康朝胜李宏伟文敏【摘要】目的探讨D半乳糖衰老模型小鼠学习记忆行为变化及对海马齿状回细胞增殖的影响。方法采用连续皮下注射D半乳糖构建亚急性衰老小鼠模型，用Y电迷宫检测衰老小鼠的学习记忆情况，并于造模完成前7d腹腔内注射5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)，行为检测完成后，取海马脑块行常规石蜡包埋，冠状连续切片，采用免疫组化法检测齿状回BrdU阳性细胞并计数。结果衰老模型小鼠呈现明显的学习记忆减退，其齿状回增殖细胞数量与正常衰老相近。结论采用连续皮下注射D半乳糖可成功构建衰老模型.f

2、reelg·kg-1·d-1；对照组，8只，皮下注射生理盐水。另设衰老组，取自然衰老小鼠(24月龄)8只。3组小鼠均于处死前7d，腹腔内注射5溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU，Sigma公司)，注射剂量为50mg/kg体重，连续7d。于模型构建完成后次日通过Y迷宫检测小鼠的学习记忆行为。1.2Y型迷宫检测移植前后小鼠的学习记忆行为学习测试：采用随机休息法进行测试。安全区以无规则次序变换，以训练小鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。小鼠受电击后逃到安全区后，灯光继续作用10～15s，熄灯后结束1次测试，小鼠所在支臂就作为下1次测试的起点，两次测试时间间隔3

3、0s或休息1min后再予以第2次测试，依次重复，测试至连续10次测试有9次以上正确者为判定标准。记忆保持测试：于学习测试24h后，再以同样方法测试至9/10标准。正确反应次数定为A，以A/10表示记忆的保持能力，此值越高说明记忆力越好。1.3动物取材、制片及免疫组化染色于行为检测完毕后次日进行取材，所有小鼠经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后，打开腹腔，暴露胸腔后，经升主动物插管，先注入20～30ml生理盐水以冲洗血液，待小鼠肝脏颜色变浅后，改用Bouin液灌注固定，每只动物灌注量约30ml；动物灌注完毕后，开颅取出脑组织，置于Bouin液中后固定24h后，进

4、行常规石蜡包埋；将各组包埋好的组织块，行冠状边续切片，片厚6μm，行BrdU免疫组化染色。BrdU免疫组化染色步骤简述如下：石蜡切片常规脱蜡至水后，滴加1∶1的50%甲酰胺/2×SSC，65℃孵育2h，入37℃2mol/LHCl浸泡60min使DNA变性；0.1mol/L硼酸缓冲液(pH=8.5)中和10min，PBS冲洗5min×3次；用3%H2O2甲醇溶液孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡；滴加正常山羊血清封闭液，室温15min，倾去不洗。滴加鼠抗BrdU单克隆抗体(滴度1∶1000，Sigma)，37℃孵育2～3h，PBS冲洗，滴加生物素

5、标记山羊抗小鼠IgG(1∶100，北京中山)，37℃15min，PBS冲洗；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液(北京中山)，37℃15min，PBS洗，DAB显色，镜下控制显色时间，流水冲洗后脱水、透明，中性树胶封片并镜检。免疫组化及免疫荧光检测过程中均以PBS代替一抗设置阴性对照，按照试剂盒操作说明进行。在40×10光镜下对各组小鼠海马齿状回BrdU阳性细胞进行计数，计数结果进行数据分析。1.4统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行t检验。2结果2.1各组小鼠学习记忆检测结果经Y型迷宫检测小鼠学习和记忆行为表明，与对照组

6、相比，模型小鼠的学习、记忆行为均有显著降低(P＜0.05)，而模型小鼠的学习记忆行为与自然衰老小鼠相比，无显著差异(P＞0.05)(见表1)。表1Y迷宫检测小鼠的学习记忆行为2.2BrdU免疫组化染色采用BrdU免疫组织化学染色表明，模型组小鼠和衰老组小鼠海马齿状回神经发生受到显著抑制(图1)。各组小鼠海马齿状回细胞计数如下：对照组(14.38±1.39)；模型组(10.38±0.60)；衰老组(8.25±0.75)；模型组、衰老组与对照组比较，均存在显著差异(P＜0.05)；而模型组与衰老组比较，无显著差异(P＞0.05)。3讨论海马是学习记忆的

7、关键脑区，参与了多种形式的学习和记忆，成年海马齿状回存在神经发生，可以产生新生的神经元，新生的神经元成熟后参与整合到已经存在的神经环路中，可以补充和替代衰老的细胞而发挥生理功能〔2〕。随着年龄增加，哺乳动物的神经发生能力逐渐降低，因为没有足够的新生神经元细胞来替换衰老和死亡的神经元，就可能导致老年性退行性疾病的发生，如早老性痴呆，老年人的记忆力持续下降，认知情感发生改变等。此外，老年大鼠齿状回颗粒细胞层神经元数目减少的原因主要是因为新生和分化的神经元减少造成的，而造成这一结果的主要原因可能是神经前体细胞增殖能力的降低〔3〕。D半乳糖致亚急性衰老动物

8、模型常运用于研究老年性疾病，不仅能较好地模拟与自然衰老相似的代谢紊乱特征，同时具有学习记忆功能下降的衰老表现