兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应

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1、兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及其对不同生长因子的反应作者：李栋，沈柏均，侯怀水，时庆，张乐玲1，马秀峰【摘要】为了研究兔骨髓间充质干细胞(rBM-MSC)的生物学特征及其对不同生长因子的反应，使用贴壁培养法从兔骨髓单个核细胞中获得间充质干细胞（MSC），在光学显微镜和电子显微镜下观察其基本生长行为和生物学特征；使用流式细胞仪检测rBM-MSC的免疫学表型；RT-PCR法检测其胶原表达；诱导rBM-MSC多向分化并使用特异性染色和RT-PCR予以鉴定；最后使用MTT法检测IL-1、3、8和HGF对rBM-MSC生长增殖的影响。结果显示：贴壁生长的rBM-MSC具有典型的成纤维样细胞形态，可传1

2、5代以上，第5代rBM-MSC高表达基质受体CD44（32％），低表达造血细胞标记CD45（4.7％）；RT-PCR显示高表达I型胶原，弱表达II型胶原，不表达X型胶原；在不同的诱导条件下，rBM-MSC可被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。rBM-MSC对IL-3最为敏感，10ng/ml的低浓度IL-3可显著促进细胞增殖达32％以上（P<0.01），而高浓度IL-3能显著抑制其生长。结论：分离培养了rBM-MSC，其生物学特征与人和猕猴等BM-MSC相似的生物学特性，低浓度IL-3可有效促进其增殖。【关键词】骨髓；间充质干细胞；生长因子；兔　　BiologicalC

3、haracteristicsofRabbitBoneMarroalStemCellsandTheirResponsetoDifferentGroedtoanalyzethebiologicalcharacteristicsofrabbitbonemarroesenchymalstemcells(rBM-MSCs)andthEirresponsetodifferentgrobonemarroononuclearcellsbyusingadherentcultivation.Biologicalcharacteristicsicroscopy.ImmunophenotypeofrBM-MSCsea

4、suredbyfloetry.Theexpressionofcollageninantcelltypeorphologyandcouldbeculturedforover15passages.CD44ethod.Invariousconditionsinductingdifferentiation,rBM-MSCscoulddifferentiateintotheosteoblast,chondrocyte,adipocyteandneuron-likecells.TherBM-MSCsl)ofIL-3couldpromotetheproliferationofrBM-MSCseffectiv

5、ely(>32％,P<0.01),ilartothoseofhumanandrhesusBM-MSCs.IL-3otetheproliferationofrBM-MSCseffectively,buthighconcentrationofIL-3caninhibitthEIrproliferation.　　Keyarroesenchymalstemcell;groarroesenchymalstemcell,BM-MSC）具有高度自我更新和多向分化的潜能，在不同的诱导条件下，可分化为多种组织细胞类型，如骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞［1］。目前对人和小鼠等物种的BM-

6、MSC　　已有深入研究，但对兔BM-MSC的生物学特性，尤其是其免疫学表型和对不同生长因子的反应鲜有报道。兔的形体较大，便于进行移植和观察，对兔BM-MSC的生物学特性进行深入的研究对实验生物学具有重要意义。本研究采用贴壁培养法，在体外培养、扩增兔BM-MSC，对其形态特征、表面标记、多向分化功能以及对不同细胞因子的反应进行初步研究，为以后的移植模型研究奠定基础。　　材料和方法　　实验动物　　3月龄雄性新西兰大白兔6只，体重1.8±0.2公斤/只，购自山东省农科院兔场。　　兔BM-MSC的分离培养　　对兔按3％戊巴比妥钠1ml/kg体重行耳缘静脉麻醉，无菌取股骨骨髓1ml（肝素终浓度50U/m

7、l）。用淋巴细胞分离液（上海华精生物公司产品，相对密度1.077）获得单个核细胞，以4×105/ml的密度悬浮于含10％小牛血清（杭州四季青产品）的高糖DMEM（Gibco/BRL公司产品）中，置100％湿度、5%CO2、37℃条件下培养72小时后全量换液，弃非贴壁细胞，每3天全量换液，约2周后贴壁细胞铺满80％瓶底，用0.25％胰蛋白酶（Gibco/BRL公司产品）常规消化传代。　　电子显微镜观