emb基因330密码子分子dna探针设计及荧光检测论文

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1、EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测论文陈庆海，府伟灵，刘春江，吴蔚，匡红【摘要】目的针对结核杆菌耐乙胺丁醇embB330密码子位点设计分子DNA探针，尝试运用荧光分光光度计直接观测液相中分子DNA探针与embB330密码子扩增产物杂交后的荧光信号，从而检出该位点突变。方法运用软件Beacondesigner设计embB基因包含330密码子的分子DNA探针，应用荧光分光光度计检测embB306密码子扩增片段与探针杂交后荧光信号.freelbB330密码子突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号存在显著差异；33

2、株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较，耐乙胺丁醇组embB330密码子突变检出率为3%，测序法突变检出率为3%。结论分子DNA探针技术可以有效检测embB330密码子单碱基靶点突变；应用荧光分光光度计直接观测液相荧光杂交信号简单、灵敏。【关键词】耐乙胺丁醇embB基因；330密码子点突变；分子DNA探针；荧光分光光度计Abstract:ObjectiveTodesignmolecularDNAprobedetectingembB330codonofEthambutolresistantmycoba

3、cteriumtuberculosis(MTB)，andtodetectfluorescenceofmutationsiteofembB330codoninliquidbyfluorescencespectrophotometer.MethodsThesoftolecularDNAprobedetectingembB306codonanddetectingfluorescencesignalfromhybridizationbetplifiedproductandprobebyfluorescencespectropho

4、tometer，andconfertothesequencingresults.ResultsThedifferencebetstandardstrainandEthambutolresistantoneisobviousindetectingthefluorescentlightbyuseoffluorescencemicroscope.B)耐药的突变基因作了详尽的研究。研究结果表明结核杆菌embB基因306位密码子突变是耐EMB产生的主要原因，其他285、303、330密码子等突变也是引起该类耐药的重要原因［1］。针

5、对广泛存在的单碱基突变位点不易检测，应用分子探针高灵敏直接检测单碱基突变是近年来一个重要技术发展。其中具有茎环结构分子DNA探针就是一类根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(FRET)现象而设计的DNA探针，对单碱基检测具有很高的灵敏性和特异性［2］。本研究选择结核杆菌耐乙胺丁醇一个重要突变位点embB330密码子，设计相应的分子DNA探针，通过扩增及杂交、采用荧光分光光度计观测液相杂交荧光信号，并比较测序结果，为结核杆菌耐药位点准确测定提供一种新手段。1材料与方法1.1乙胺丁醇耐药菌株、标准株来源及其基因组DNA提取

6、结核分枝杆菌标准株H37RV(ATCC27294)来源于中国药品生物制品鉴定所，耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株来源于重庆市肺科医院（42RE＼A021E＼307E等共33株），金葡菌对照组来源于本科室。按全国结核病细菌学检验标准化规程进行分支杆菌培养(Roch培养基)、菌种鉴定和药敏试验。灭活条件为：85℃，1h。采用QIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株和标准株DNA提取后，置-20℃冰箱中备用。1.2主要仪器荧光分光光度计、热循环仪(GeneAmpPCRSystem2700型

7、)、碧云天恒温水平摇床、电泳仪、离心机等。1.3引物及分子DNA探针设计、合成经查寻文献，选择结核杆菌耐乙胺丁醇(EMB)emb基因包含330密码子突变位点的序列设计分子DNA探针。登陆GenBank，找到结核杆菌耐乙胺丁醇(EMB)emb基因包含330密码子突变位点序列，在PrimerPremierV5.0软件上设计结核合杆菌特异性引物，经NCBIBLAST比对验证。分子DNA探针设计软件采用Beacondesigner软件。引物embB306codonPrimer1：5′AGCTGGCGCACCTTCACCCT3

8、′，引物embB306codonPrimer2：5′TGGCAGGCGCATCCACAGA3′，分子DNA探针TBembB330codonMB：5′FAMAGTCCAGTGGAGGATCCCTTCGGCTGGACTGGACTDABCYL3′。引物及探针均由上海生工生物科技有限公司合成。1.4结核杆菌em