emb基因330密码子分子dna探针设计及荧光检测

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1、EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测作者：陈庆海，府伟灵，刘春江，吴蔚，匡红【摘要】目的针对结核杆菌耐乙胺丁醇embB330密码子位点设计分子DNA探针，尝试运用荧光分光光度计直接观测液相中分子DNA探针与embB330密码子扩增产物杂交后的荧光信号，从而检出该位点突变。方法运用软件Beacondesigner设计embB基因包含330密码子的分子DNA探针，应用荧光分光光度计检测embB306密码子扩增片段与探针杂交后荧光信号，比较扩增产物测序结果。结果通过荧光分光光度计观测到结核标准株及embB330密码子突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号存在显著

2、差异；33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较，耐乙胺丁醇组embB330密码子突变检出率为3%，测序法突变检出率为3%。结论分子DNA探针技术可以有效检测embB330密码子单碱基靶点突变；应用荧光分光光度计直接观测液相荧光杂交信号简单、灵敏。【关键词】耐乙胺丁醇embB基因；330密码子点突变；分子DNA探针；荧光分光光度计Abstract:ObjectiveTodesignmolecularDNAprobedetectingembB330codonofEthambutolresistantmycobacterium9tuberculosi

3、s(MTB)，andtodetectfluorescenceofmutationsiteofembB330codoninliquidbyfluorescencespectrophotometer.MethodsThesoftware，beacondesigner，wasusedtodesignmolecularDNAprobedetectingembB306codonanddetectingfluorescencesignalfromhybridizationbetweentheamplifiedproductandprobebyfluorescencespectro

4、photometer，andconfertothesequencingresults.ResultsThedifferencebetweenPCRproductsfromstandardstrainandEthambutolresistantoneisobviousindetectingthefluorescentlightbyuseoffluorescencemicroscope.Wedetectedfluorescentlightsignalbetweenthe33Ethambutolresistantstrainsand10H37RVstandardstrain

5、s.TherateofresistantEthambutoldetectedisabout3%，andtherateofsequencingisabout3%.ConclusionThetechnologyofmolecularDNAprobecaneffectuallydetectamutationsinglebasylsiteofembB330codon.Fluorescencespectrophotometerhavecharacteristicssuchashighsensitiveness，simpletodirectlydetectthefluoresce

6、ntlightinliquid.Keywords:EthambutolresistantembBgene;330codonofmutationsite;molecularDNAprobe;fluorescencespectrophotometer9近年来，国内外学者在分子水平上对引起结核乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)耐药的突变基因作了详尽的研究。研究结果表明结核杆菌embB基因306位密码子突变是耐EMB产生的主要原因，其他285、303、330密码子等突变也是引起该类耐药的重要原因［1］。针对广泛存在的单碱基突变位点不易检测，应用分子探针高灵敏直接检测单碱

7、基突变是近年来一个重要技术发展。其中具有茎环结构分子DNA探针就是一类根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(FRET)现象而设计的DNA探针，对单碱基检测具有很高的灵敏性和特异性［2］。本研究选择结核杆菌耐乙胺丁醇一个重要突变位点embB330密码子，设计相应的分子DNA探针，通过扩增及杂交、采用荧光分光光度计观测液相杂交荧光信号，并比较测序结果，为结核杆菌耐药位点准确测定提供一种新手段。1材料与方法1.1乙胺丁醇耐药菌株、标准株来源及其基因组DNA提取结核分枝杆菌标准株H37RV(ATCC927294)来源于中国药品生物制品鉴定所，耐乙胺丁醇结核