编码小鼠分泌型klotho蛋白的cdna克隆及其重组腺相关病毒载体构建论文

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1、编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建论文【摘要】目的克隆编码小鼠分泌型Klotho蛋白(secKlotho)的全长cDNA片段，构建secKlotho重组腺相关病毒载体。方法以小鼠肾脏组织mRNA为模板，通过RTPCR扩增获得小鼠Klotho基因大片段并克隆至pMD18T载体中，再采用长臂引物进行二次PCR扩增获得编码secKlotho的全长cDNA片段，经EcoRI/XhoI酶切、连接、转化将目的片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAVMCS中，酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定

2、。结果RTPCR成功扩增出1600bp的小鼠Klotho基因大片段，经二次PCR扩增得到编码secKlotho的全长1650bpcDNA片段，并最终获得3个序列信息和读码框完全正确的pAAV/secKlotho克隆。结论成功构建小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体.freelousesecretedformofklothoprotein(secKlotho),andtoconstructtherebinantadenoassociatedvirus(rAAV)vectorcarryingtheopenrea

3、dingframe(ORF)ofsecKlotho(pAAV/secKlotho).MethodsUsingthemRNAextractedfrommousekidneyastemplate,partofmouseklothogeneplifiedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)andclonedintopMD18Tvector.ThenthefulllengthcDNAfragmentcodingformousesecretedformo

4、fklothoprimers.Afterdigestion,ligationandtransformation,thetargetedcDNAfragmentidpAAV/secKlotho.pAAV/secKlothoplification,thesequenceofedthattheORFofsecKlothoentofpAAV/secKlotho，购自Stratagene公司。大肠杆菌E.coliDH5α为本室保存。1.1.2试剂各种限制性内切酶均购自NEB公司、一步法RTPCR试剂盒、DNAMarker、

5、DNA连接试剂盒购自TakaRa公司，质粒提取试剂盒购自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。1.2方法1.2.1克隆小鼠Klotho基因大片段提取健康Balb/c小鼠的肾脏组织mRNA，应用TakaRa公司的一步法RTPCR试剂盒反转录扩增Klotho基因的前3个外显子序列，RTPCR的上游引物序列为：5′gctcccgcagcatgctagcc3′(黑体部分为翻译起始密码子);下游引物序列为：5′tgaacgtagttgtcaactccc3′，RTPCR反应条件为：首先42℃30m

6、in，95℃变性5min进行反转录，随后95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，循环35次，再72℃延伸5min，进行PCR扩增。扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定片段大小，胶回收PCR产物，然后与pMD18T载体进行连接，连接产物电转化E.coliDH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落于37℃振荡培养过夜后提取质粒，限制性内切酶鉴定后送上海生工生物工程公司进行DNA测序。1.2.2小鼠secKlotho全长cDNA片段的获得以测序结果正确的pMD18T/Klotho质粒

7、DNA为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR上游引物序列为：5′gatcgaattcatgctagcccgcgcccctcctc3′(黑体部分为翻译起始密码子，下画线部分为EcoRI识别位点序列);PCR下游引物序列为：5′agtcctcgagctagtgaggaagcaagaggccgacactgggttttgtcaaaggacttacttgaacgtagttgtcaacaactcc3′(黑体部分为翻译终止密码子，下画线部分为XhoI识别位点序列，斜体部分为插入的50bp特定序列)，PCR反应条件同上。PC

8、R扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定片段大小，胶回收PCR产物，置pH8.0TE缓冲液中,-20℃保存。1.2.3重组pAAV/secKlotho质粒的构建首先应用EcoRI/XhoI分别对腺相关病毒空载体pAAVMCS和secKlothoPCR产物进行双酶切，胶回收目的片段，然后将酶切后载体与PCR片段按1∶3(摩尔数比)进行连接，连接产物电转化