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时间:2018-07-07
《人ccr5delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建 论文》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建 论文安群星,穆士杰,张献清,陈蕤,张颖,余瑞,刘宁【摘要】目的:克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLentiCCR5Delta32,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究.方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA.freelT载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序.再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5DTOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析.结果:经
2、PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与GenBank上的序列完全一致,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5DTOPO中.结论:成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLentiCCR5Delta32,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础.【关键词】人CCR5Delta32基因;基因克隆;慢病毒载体;HIV感染;AIDS【Abstract】AIM:ToclonehumanCCR5Delta32geneandconstructtherebinantlentiviralvectorpLentiCCR5Delta32fo
3、rthefurthergenetherapyofAIDS.METHODS:FulllengthCCR5Delta32geneplifiedbyusingPCRfromhumanperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)genomicDNA,andthenclonedintopUCmT.Aftersequenceanalysis,theCCR5Delta32geneentof650bpityanCCR5Delta32geneisclonedcorrectlyandtherebinantlentiviralvectorpLentiCCR5Delta32
4、isconstructedsuccessfully,andalltheselayafoundationforfurtherstudyingthegenetherapyofAIDS.【KeyT载体和pLenti6/V5DTOPO载体(Invitrogen公司);基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司);胶回收试剂盒(宝信公司);质粒快速提取试剂盒(Promega公司);TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶以及限制性内切酶EcoRI,BamHI和PstI(TaKaRa公司).1.2方法1.2.1外周血基因组DNA的提取按QIAampBloodKit说明书提供的操作步骤进行.取CCR5
5、Delta32突变个体外周静脉抗凝血约200μL(标本来自解放军第302医院住院患者),加入蛋白酶K和裂解缓冲液,振荡混匀,70℃温育10min.之后加入无水乙醇,振荡混匀后将其加入到QIAampspin柱内,用清洗缓冲液洗涤柱子2次,最后用预热的洗脱缓冲液洗脱柱内的基因组DNA.1.2.2PCR引物设计与合成根据GenBank中的CCR5Delta32基因序列设计引物如下:上游5′GAATTCGCCACCATGGATTATCAAGTGTCAAGTC3′,下游5′GAATTCTCATTTCGACACCGAAGC3′.引物由上海生工生物工程技术有限公司负责合成.1.2.3目的基因的扩增以人
6、外周血单个核细胞(PBMCs)基因组DNA为模板,利用上述引物通过PCR技术扩增目的基因片段.反应体系:PBMCs基因组DNA4μL,10×PCRBuffer(Mg2+plus)5μL,dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL,引物(20μmol/L)各2μL,Taq酶(5×106U/L)0.5μL,最后加水至终体积50μL.反应条件:94℃预变性5min,然后按94℃30s,55℃50s,72℃1min扩增30个循环,最后72℃延伸10min.取15μLPCR产物进行12g/L琼脂糖凝胶电泳,切胶回收目的片段.1.2.4目的基因的克隆与鉴定用EcoRI单酶切PCR产物及pU
7、CmT载体,胶回收后用T4DNA连接酶连接,随后转化E.coliDH5α.提取质粒进行EcoRI单酶切鉴定,最后将筛选得到的阳性质粒pUCmCCR5Delta32交由上海生工进行测序.1.2.5重组慢病毒载体的构建分别用EcoRI单酶切pUCmCCR5Delta32及pLenti6/V5DTOPO载体,胶回收CCR5Delta32片段及线性化的pLenti6/V5DTOPO载体.用T4DNA连接酶将两者连接,转化E.c
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