人ccr5delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建　论文

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1、人CCR5Delta32基因的克隆及其重组慢病毒载体的构建　论文安群星，穆士杰，张献清，陈蕤，张颖，余瑞，刘宁【摘要】目的：克隆人CCR5Delta32基因并构建含目的基因的重组慢病毒载体pLentiCCR5Delta32，用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究.方法：从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞（PBMCs）内提取人基因组DNA.freelT载体连接，随后转化感受态E.coliDH5α，提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序.再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5DTOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析.结果：经

2、PCR扩增获得约650bp的DNA片段，测序结果与GenBank上的序列完全一致，克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5DTOPO中.结论：成功克隆了人CCR5Delta32基因并构建了含目的基因的重组慢病毒载体pLentiCCR5Delta32，为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础.【关键词】人CCR5Delta32基因；基因克隆；慢病毒载体；HIV感染；AIDS【Abstract】AIM:ToclonehumanCCR5Delta32geneandconstructtherebinantlentiviralvectorpLentiCCR5Delta32fo

3、rthefurthergenetherapyofAIDS.METHODS:FulllengthCCR5Delta32geneplifiedbyusingPCRfromhumanperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)genomicDNA,andthenclonedintopUCmT.Aftersequenceanalysis,theCCR5Delta32geneentof650bpityanCCR5Delta32geneisclonedcorrectlyandtherebinantlentiviralvectorpLentiCCR5Delta32

4、isconstructedsuccessfully,andalltheselayafoundationforfurtherstudyingthegenetherapyofAIDS.【KeyT载体和pLenti6/V5DTOPO载体（Invitrogen公司）；基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）；胶回收试剂盒（宝信公司）；质粒快速提取试剂盒（Promega公司）；TaqDNA聚合酶,T4DNA连接酶以及限制性内切酶EcoRI,BamHI和PstI（TaKaRa公司）.1.2方法1.2.1外周血基因组DNA的提取按QIAampBloodKit说明书提供的操作步骤进行.取CCR5

5、Delta32突变个体外周静脉抗凝血约200μL（标本来自解放军第302医院住院患者），加入蛋白酶K和裂解缓冲液，振荡混匀，70℃温育10min.之后加入无水乙醇，振荡混匀后将其加入到QIAampspin柱内，用清洗缓冲液洗涤柱子2次，最后用预热的洗脱缓冲液洗脱柱内的基因组DNA.1.2.2PCR引物设计与合成根据GenBank中的CCR5Delta32基因序列设计引物如下：上游5′GAATTCGCCACCATGGATTATCAAGTGTCAAGTC3′，下游5′GAATTCTCATTTCGACACCGAAGC3′.引物由上海生工生物工程技术有限公司负责合成.1.2.3目的基因的扩增以人

6、外周血单个核细胞（PBMCs）基因组DNA为模板，利用上述引物通过PCR技术扩增目的基因片段.反应体系：PBMCs基因组DNA4μL，10×PCRBuffer(Mg2+plus)5μL，dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL，引物（20μmol/L）各2μL，Taq酶(5×106U/L)0.5μL，最后加水至终体积50μL.反应条件：94℃预变性5min，然后按94℃30s，55℃50s，72℃1min扩增30个循环，最后72℃延伸10min.取15μLPCR产物进行12g/L琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段.1.2.4目的基因的克隆与鉴定用EcoRI单酶切PCR产物及pU

7、CmT载体，胶回收后用T4DNA连接酶连接，随后转化E.coliDH5α.提取质粒进行EcoRI单酶切鉴定，最后将筛选得到的阳性质粒pUCmCCR5Delta32交由上海生工进行测序.1.2.5重组慢病毒载体的构建分别用EcoRI单酶切pUCmCCR5Delta32及pLenti6/V5DTOPO载体，胶回收CCR5Delta32片段及线性化的pLenti6/V5DTOPO载体.用T4DNA连接酶将两者连接，转化E.c