风湿性心脏病心房纤颤和非心房纤颤患者心房肌细胞内钙离子浓度变化论文

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1、风湿性心脏病心房纤颤和非心房纤颤患者心房肌细胞内钙离子浓度变化论文.freelolL-1vs（262±65）nmolL-1，两组间差异显著（P0.01）.结论RHD伴AF患者心房肌细胞内存在Ca2+超载.Keyaticheartdisease;calci-um;Fluo-3Abstract:AIMToobserveyocytesofrheumaticheartdiseasepatientsyocytesofrheumaticheartdiseasepatientsea-suredicroscopy.RESULTSIntracellular

2、Ca2+concentrationofatrialfibrillationgroupolL-1vs（262±65）nmolL-1）］.CONCLUSIONCa2+overloadexistsinatrialmyocytesofrheumaticheartdiseaseodeling.freelan等［4］的研究还发现，应用钙离子拮抗剂维拉帕米能有效地预防和减轻AER，推测心房肌细胞内钙超载可能是AER的原因.但这一推测尚无直接证据.我们应用激光共聚焦显微镜技术定量测定风湿性心脏病（rheumaticheartdisease，RHD）AF患

3、者心房肌细胞内钙离子浓度，检验该类患者心房肌细胞内是否存在钙超载.1材料和方法1.1试剂和溶液［5］Tyrode液（molL-1）:NaCl126.0，KCl5.4，MgCl20.8，CaCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES10.0，Glucose5.5.无钙Tyrode液按Tyrode液配方不加CaCl2.Fluo-3/Am（美国BIO-RAD）.胶原酶（日本Yakult）.蛋白酶XXIV（美国Sigma）.牛血清白蛋白（美国Amerco）.1.2病例及分组所有病例均为1999-01/1999-05来我院行心脏外科手术的患者

4、.实验组:RHD伴有AF（n=8，男3，女5），平均年龄（44±9）岁.对照组:RHD不伴有AF（n=6，男2，女4），平均年龄（43±10）岁.2组间年龄无显著差异（P0.05），2组患者心脏瓣膜病变情况大致相同，均无充血性心力衰竭，均为二尖瓣中-重度狭窄伴中-重度返流并行二尖瓣膜置换手术.实验组AF病程为（13.1±6.4）mo.1.3单个人心房肌细胞的分离［6］将手术中获得的小块右心耳组织迅速置于预先氧合30min的无Ca2+Tyrode液中，并于5min内送回实验室.用无Ca2+Tyrode液清洗组织，然后将组织剪成1mm×1mm

5、×1mm大小碎块，置于含有蛋白酶ⅩⅩⅣ型33.3μmolL-1，胶原酶3.33mmolL-1的无Ca2+Tyrode液中，于37℃在充氧条件下消化40min，而后将组织块移至含有胶原酶3.33mmolL-1的无Ca2+Tyrode液中消化10～20min.将组织块移至含有牛血清白蛋白的无Ca2+Tyrode液中，吹打，即可获得单个人心房肌细胞.1.4人心房肌细胞内钙离子浓度的测定1.4.1测定原理［7］Fluo-3是一敏感性钙指示剂，能特异性与Ca2+结合，并在一定波长激光激发下产生荧光，其荧光强度与Ca2+浓度成正比，因而可用于Ca2+

6、浓度的定量观察.但Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞膜，而当其结合上亲脂的2-酰羟甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM，在与细胞温育时，很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯基脱去生成游离的Fluo-3.1.4.2Fluo-3/AM的荷载［8］采用离心方法（1000rmin-1，5min）使用Tyrode液（pH7.4）洗涤获得的人心房肌细胞2次，于37℃避光条件下用Fluo-3/Am（4.4μmolL-1）荷载.90min后用Tyrode液洗涤细胞3次，洗去细胞外液残余染料，最后保留少许细胞外Tyrode液.1.4.3

7、细胞内Ca2+浓度的测定［9］Fluo-3/AM荷载的人心房肌细胞在共聚焦显微镜（MRC-1024，BIO-RAD）下扫描细胞内荧光强度，激发波长488nm，放射波长526nm.应用数字传入式摄像机和高速度计算机处理软件得到清晰的细胞内分布图像.利用其图像量化、分析系统进行图像分析.［Ca2+］i由下面公式得出:［Ca2+］i=kd［（F-Fmin）/（Fmax-F）］，kd是Fluo-3与Ca2+反应解离常数，kd=400nmolL-1，F为所测得的荧光强度值，Fmax和Fmin分别为Ca2+饱和及无Ca2+时的胞内荧光强度.每例患者测

8、定3个心房肌细胞，取其平均值作为该患者的心房肌细胞内游离Ca2+浓度.统计学处理:所有数据均用x±s表示，两组间比较用t检验.2结果对细胞荷载Fluo-3/AM后的细胞内游离Ca2+图像观察发