抗癫疒间药物诱导对血脑屏障上p

《抗癫疒间药物诱导对血脑屏障上p》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、抗癫疒间药物诱导对血脑屏障上P作者：王琳琳，刘晓东，王靖元【摘要】目的研究长期使用抗癫疒间药物(AEDs)对大鼠脑中P-糖蛋白(P-gp)功能活性和表达水平的影响。方法选择苯巴比妥、苯妥英钠和卡马西平三个典型AEDs，在大鼠体内连续给药21天，然后观察脑组织中皮质和海马P-gp的改变。结果底物罗丹明123转运实验表明P-gp功能增强，进一步通过RP)等[1-2]。血脑屏障主要由单层脑微血管内皮细胞构成，调节和保护大脑微环境。P-gp是血脑屏障上一种重要的外排转运蛋白，许多药物包括一些抗癫疒间药物(antiepilepticdrugs，AEDs)都是它的底物

2、[3-4]。有研究发现AEDs诱导的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)中P-gp表达显著高于正常对照组，且呈剂量和时间依赖性[5]。因为BMECs是构成血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)的主要形态学基础，那么为了证实AEDs是否也会对BBB上的P-gp产生诱导作用，且其是否是癫疒间患者长期用药后出现治疗失败的原因之一，本实验探讨长期使用AEDs是否可以诱导大鼠脑中P-gp功能活性和表达水平的上调。　　1材料和方法　　1.1药品与试剂罗丹明123标准品(rhodamine

3、123，Rho123)购自美国Sigma公司;甲醇为色谱纯(美国FisherInc.);苯巴比妥(phenobarbital，PB)购自上海新亚药业有限公司;苯妥英钠(phenytoinsodium，PHT)购自天津力生制药股份有限公司;卡马西平(carbamazepine，CBZ)购自上海三维制药有限公司;鼠anti-P-gp一抗(C219，IgG)购自美国CalbiochemofEMDBiosciencesInc.;IRDyeTM800抗鼠IgG二抗购自美国RocklandInc.;鼠anti-β-actin单克隆抗体购自中国BosterBiotech

4、公司;其余试剂均为市售分析纯。　　1.2仪器LC-10ADVP高效液相色谱仪，RF-10AXL荧光检测器(日本Shimadzu);5810R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf);61型电泳仪(北京六一仪器厂);半干转膜仪(北京六一仪器厂);6131型核酸、蛋白质含量测定仪(德国EppendorfInc.)。　　1.3动物与分组健康雄性Sprague-Dag/kg，苯妥英钠组给予苯妥英钠25mg/kg，卡马西平组给予卡马西平50mg/kg，正常对照组给予等体积的羧甲基纤维素钠，给药体积为1ml/100g。每天灌胃给药2次，连续给药21天。　　1.4方

5、法　　1.4.1P-gp功能分析给药周期结束后，AEDs诱导组大鼠与正常对照组大鼠静脉注射Rho1230.2mg/kg(临用前以生理盐水配制成0.1g/L，给药体积为2ml/kg)，60min后股动脉取血(约3ml)于肝素化试管中，立即断头处死大鼠，剥取脑皮质与海马。血液离心(4000r/min，5min)后取上层血浆，采用甲醇沉淀蛋白，通过HPLC-FLD进行血浆、脑皮质与海马中Rho123浓度测定，具体条件如下：流动相为乙腈-水相(1‰乙酸，2‰三乙胺)=40∶60，流速1ml/min，检测波长：Ex485nm，Em546nm，以脑皮质/血浆、海马/血

6、浆的浓度比值进行统计分析。　　1.4.2免疫组织化学染色给药周期结束后，AEDs诱导组大鼠与正常对照组大鼠用乙醚麻醉后立即断头处死，剥取脑皮质与海马。相对于前囟点-0.8mm、-3.8mm分别取含皮质、海马结构的2～3mm厚脑块(冠状切面)，置福尔马林溶液中梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，切片。石蜡切片常规脱蜡和水化后，加50μl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10min，PBS冲洗3min×3次;加50μl正常非免疫动物血清，室温下孵育10min;加100μl一抗(1∶100稀释)，37℃孵育60min;加50μl二抗(1∶100稀释)，室温下孵育10min

7、，PBS冲洗3min×3次;加50μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10min，PBS冲洗5min×3次;DAB显色，脱水，透明，封片。　　切片在Olympus-Vanox显微镜下观察并照相，照片导入ImagePro-Plus显微图像分析系统进行数据分析，选定阳性细胞后获得光密度(D值)表示P-gp免疫反应强度。　　1.4.3蛋白印迹检测P-gp表达定量称取大鼠脑皮质、海马，加入Chaps裂解液冰浴裂解1h，离心取上清液;膜蛋白液经核酸定量仪测定后100℃、5min变性;加入4×loadingbuffer上样，100V电泳2.5h;转

8、膜，10%脱脂奶粉37℃封闭1h;PBST清洗10min×3次，加