超声微泡辅助干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究

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1、超声微泡辅助干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究作者：徐琢，冯毅，童嘉毅，李金鹆，马根山,沈成兴，祁春梅，苏亚民，张晓黎，杨芳,张宇【摘要】目的：探讨超声微泡在自体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)移植治疗猪急性心肌梗死(AMI)改善心功能中的作用。方法：选取14只3～4月龄小型家猪,抽取骨髓,分离、培养、标记BMMSCs，球囊封堵猪左冠状动脉前降支(LAD)建立AMI模型，分为实验组（超声微泡作用下移植干细胞，n=8）和对照组（无超声微泡作用，n=6）,7d后向LAD梗死处输注自体BMMSCs移植治疗。在移植前1d和移植后6周分别行64层螺旋CT心脏扫描及

2、组织病理学检查。结果：与对照组相比，实验组心功能改善更为明显，梗死区毛细血管数（16.37±3.20vs9.50±1.87，P<0.05）、普鲁士蓝染色阳性细胞数（71.63±14.09vs40.67±9.48，P<0.05）、结蛋白免疫组化染色阳性细胞数（31.88±4.16vs19.00±2.28，P<0.05）均明显增加。结论:超声微泡增效自体BMMSCs移植治疗AMI，能更有效地改善心肌梗死后的心功能,促进血管新生。【关键词】超声；微泡；骨髓间充质干细胞；干细胞移植；急性心肌梗死；动物模型；猪虽然药物和血运重建技术在不断进步,但对

3、心肌梗死后心肌组织不能再生所导致的心力衰竭仍无有效的治疗手段。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）具有心肌分化潜能,干细胞移植促进心肌组织再生有望成为治疗急性心肌梗死（AMI）新的有效手段，但干细胞移植效率低一直是困扰研究者们的难题。本研究在超声微泡干预下行自体BMMSCs移植，观察超声微泡在干细胞移植中的作用及其对心功能及心肌微循环改善程度的影响，为临床应用BMMSCs移植治疗AMI提供依据。1材料和方法1.1材料选择3～4月龄的中国小型雄性家猪14只，体重（30±5）kg，由东南大学动物实验中心提供，随机分为超声微泡作用下移植干细胞的实验组（8只）和无超声

4、微泡作用的对照组（6只）两组。1.2方法1.2.1BMMSCs的分离、培养和标记于胫骨近端抽取骨髓血约20ml,应用Percoll（相对密度1.077）分离液离心提取BMMSCs,用含10%胎牛血清的低糖DMEM进行培养。在细胞接近汇合时以1∶3的比例传代。在移植前1d对细胞进行标记,在培养液中加入超顺磁氧化铁（SPIO）溶液(培养液SPIO浓度25μg·ml－1)，继续培养24h后，0.25%胰蛋白酶溶液消化贴壁细胞，悬浮备用。1.2.2AMI模型的建立家猪经股动脉穿刺行选择性左冠状动脉造影，经6F指引导管送入0.014in（1in=0.0254m）导丝

5、，导丝前端达左冠状动脉前降支(LAD)远端后固定导丝。在X射线透视下，再沿导丝导入球囊（2.0～2.5）mm×（10～15）mm至前降支中远端。球囊打开前静脉予150mg可达龙预防缺血性心律失常发生，之后以4atm(1atm=101.325kPa)扩张1、3、5min作3次缺血预适应，然后以4atm扩张60min作梗死模型，术中注意心电图改变，然后撤出球囊及导丝,再行左冠状动脉造影，结扎股动脉。1.2.3超声微泡作用和BMMSCs输注7d后再次行股动脉穿刺送入OTHz，机械指数1.6，深度9cm）持续照射心尖部，随后导管内注入2mlBMMSCs悬液（1×1

6、07个细胞）。对照组无超声微泡作用以同样方法输入等量BMMSCs。1.2.4螺旋CT心功能测定BMMSCs移植前1d及移植后6周分别进行64层螺旋CT检查（西门子SOMATOMSensation64，扫描层厚0.6mm）。经容积再现、多层面重建、最大密度投影等图像后处理得到收缩末期容积、左室射血分数。1.2.5细胞鉴定、计数及梗死交界区毛细血管密度计算细胞移植后6周取梗死交界区组织切片，分别进行HE、普鲁士蓝染色及结蛋白免疫组化染色，10×20倍视野下随机计数5个视野的毛细血管数、普鲁士蓝染色阳性细胞数及结蛋白免疫组化染色阳性细胞数，取其平均数。1.3统计

7、学处理采用SPSS12.0统计软件包进行数据分析，所有数据用x-±s表示，用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1移植前后心脏功能与对照组比较，实验组血流动力学指标改善更为明显（表1）。表1两组家猪细胞移植前后心功能的比较与对照组及移植前比较，均P<0.052.2心肌组织学检查结果与对照组比较，实验组毛细血管数、普鲁士蓝染色阳性细胞数及结蛋白免疫组化染色阳性细胞数显著增多，见图1(封三)及表2。表2两组家猪移植部位心肌组织学检查结果比较3讨论自体BMMSCs移植已经应用于临床治疗缺血性心脏病，达到抑制心肌重构和改善心功能的效果［1

8、］，但心外膜直接心肌注射、经心内膜心肌内注射或经导管冠状动脉内注射