超声联合一氧化氮微泡增效间充质干细胞移植治疗心肌梗死及机制的实验研究

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1、东南大学硕士学位论文超声联合一氧化氮微泡增效间充质干细胞移植治疗心肌梗死及机制的实验研究姓名：卞叶萍申请学位级别：硕士专业：临床医学指导教师：童嘉毅2012-05-31东南大学硕士学位论文中文摘要超声联合一氧化氮微泡增效间充质千细胞移植治疗心肌梗死及机制的实验研究研究生：卞叶萍导师：童嘉毅东南大学医学院背景不断提高骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗心肌梗死(MI)效率是亟待解决的问题。近期多项实验研究发现超声联合微泡干预有增效干细胞移植治疗MI的作用，具有良好的应用前景。本课题组前期研究发现超声联合一氧化氮(NO)微泡体外干预MSCs对其增殖、凋亡以及细胞周期无显著影响。超声联合NO微泡介导

2、MSCs移植治疗MI的体内效应及机制的研究尚属空白。目的1．探讨超声联合N0微泡促进经静脉移植MSCs归巢大鼠缺血心肌的可行性及可能机制；2．探讨超声联合N0微泡干预MSCs移植改善梗死后心功能的有效性及可能机制。方法l、大鼠骨髓MSCs的分离培养、鉴定及标记：密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓MSCs；形态学观察及流式细胞仪检测CD44、CD29、CD34及CD45进行MSCs鉴定；CM—Dil体外标记MSCs，荧光显微镜观察标记效率。2、大鼠M工模型的制备与评价：冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型，以心电图、血清学、影像学及病理学等指标评价模型制各成功与否。3、超声联合NO微泡干预MSCs

3、移植治疗心肌梗死的效应及机制：①40只大鼠成功制备MI模型一周后随机分为PBS组、MSCs组、超声联合微泡组及超声联合NO微泡组(n=10)。PBS组直接从尾静脉注射2mLPBS，其余不作干预；MSCs组直接将CM-Dil标记的MSCs约lxl07细胞量用2mLPBS稀释后经静脉缓慢注射，其余不作干预；超声+微泡+MSCs组首先经尾静脉注入普通声诺维微泡0．ImL／kg，注入微泡同时启动超声，1MHz、2W／cm2，作用10分钟，作用结束后将CM—Dil标记的MSCs约Ixl07细胞量用2mLPBS稀释后静脉缓慢注射；超声+NO微泡+MSCs组移植方法及条件同超声+微泡+MSCs组，仅将普通微

4、泡换作N0微泡，用量同普通微泡。②干预后48h随机处死每组各3只大鼠，取梗死区心肌组织作冰冻切片，计数比较各组缺血心肌内荧光标记阳性MSCs。③4周后对每组剩余大鼠行M型心脏超声观察比较各组左心室收缩功能。．④心功能检测结束后处死所有大鼠，取梗死区心肌组织行石蜡切片及HE染色，中文摘要计数比较各组心肌缺血区的毛细血管密度，同时应用Western—blotting及RealTimePCR检测比较局部心肌SDF-1、VEGF的表达水平。结果l、密度梯度离心法分离培养的MSCs贴壁生长，以梭形为主，形态较均一。流式细胞检测结果显示细胞表面高表达CD44(99．34％)及CD29(99．35％)，几乎

5、不表达CD34(1．47％)及CD45(1．56％)。荧光显微镜观察显示绝大部分细胞均可被CM—Dil标记，细胞膜呈均匀明亮的红色，CM—Dil标记的阳性率约为96．72％。2、冠状动脉左前降支结扎法建立MI模型后，心电图呈现ST段偏移、病理性Q波等动态变化，TnI、CK-MB明显升高，Masson染色左室前壁梗死区呈蓝染，左室收缩功能明显降低。3、荧光显微镜观察计数各组心肌缺血区CM—Dil阳性MSCs显示：超声+NO微泡+MSCs组荧光阳性细胞数为59．22±17．63个，较超声+微泡+MSCs组(45．33±14．97)及MSCs组(31．88±5．71)增多，差异有统计学意义(P

6、05)。4、心功能检测结果显示：超声+NO微泡+MSCs组EF值为56．27±3．66％，较超声+微泡+MSCs组(51．31±3．22％)、MSCs组(45．81±3．37％)及PBS组(43．66±4．79％)显著改善，差异有统计学意义(P

7、O微泡+MSCs组SDF—l、VEGF的表达水平较其他各组升高。结论1．密度梯度离心法可成功实现大鼠BMSCs的分离培养。2．冠状动脉左前降支结扎法可建立稳定的大鼠MI模型。3．CM-Dil可以在体外有效标记MSCs，标记方法简单、操作简便，并且可以有效示踪MSCs在体内的分布。4．超声联合NO微泡可促进静脉移植的MSCs向心肌缺血区归巢，可能与超声联合NO微泡促进局部SDF-1的表达有关。5．超