pc12细胞转染nnosα和nnosβ对nf kappa b转录活性和细胞凋亡的影响论文

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1、PC12细胞转染nNOSα和nNOSβ对NFkappaB转录活性和细胞凋亡的影响论文金小高罗爱林王萍王金韬张广雄王贤裕李亚文【摘要】目的：比较转染nNOSα和nNOSβ的PC12细胞NFkappaB转录活性和细胞凋亡百分数，探讨nNOSα和nNOSβ在功能上的差异性.方法：将携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒转化感受态细胞，在大肠杆菌中扩增后，提纯质粒酶切鉴定.nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0表达质粒通过脂质体转染PC12细胞，G418筛选，使用抗nNOS羧基端的抗

2、体，通过免疫组织化学和SA）检测细胞核NFkappaB转录活性.不同PC12细胞经PI染色后流式细胞仪分选.freelinetheeffectsofoverexpressionofnNOSαandnNOSβonNFkappaBactivityandapoptosisinPC12cells.METHODS:TheexpressionvectorsofpcDNA3nNOSαandpcDNA3nNOSβationprocess.Thevectorsit.ThenPC12cellsmunohistoc

3、hemistryandSA).ThepercentageofsubG1/G0inedbyfloetry(FCM)iodide(PI).RESULTS:Thenumberandsizeofdigestedproductsingeleletrophoresismunohistochemistryand2000购自美国Invitrogen公司；DMEM/F12培养基、抗nNOS抗体购自北京中山公司；NuclearandCytoplasmicExtractionReagents试剂盒购自美国Pierce生物

4、技术公司；新霉素类似物G418,NFkappaB结合系列5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′(双链)，碘化丙啶PI染料购自美国Sigma公司.1.2方法1.2.1转化扩增使用大肠杆菌与CaCl2在冰上共孵育制备感受态细胞，通过热休克的方式将携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒转化感受态细胞，氨苄青霉素筛选后，在培养基LB中大量扩增.1.2.2酶切鉴定小量抽提（碱裂解法）质粒，内切酶HindⅢ酶切带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒，酶切产物加样于10

5、g/L琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察结果，并拍照分析.1.2.3PC12细胞的转染及筛选PC12细胞采用DMEM/F12培养基,150g/L胎牛血清于多聚赖氨酸包被的培养瓶中培养.在PC12细胞覆盖培养瓶达到90％左右时，使用脂质体将携带nNOSα和nNOSβ基因的pcDNA3.0质粒分别转染PC12细胞，培养1～2d后，经G418筛选2~3ol/LPBS洗净，无水甲醇固定.经羊血清封闭后，依次加入抗nNOS抗体（北京中山公司）、生物素标记的抗兔二抗、亲和素和过氧化物酶复合物，DAB显色，检测nNO

6、S的表达.苏木素复染后，脱水、透明和封片.1.2.5筛选后PC12细胞胞浆和核蛋白的提取收集未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞，1500r/min离心后，使用NuclearandCytoplasmicExtractionReagents试剂盒分别提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白，考马斯亮蓝G250法蛋白定量，-80℃储存备用.1.2.6SA）［8-10］分别取未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞细胞核蛋白20μg，分别与［γ32］P标记的NFkappaB结合系列5′AG

7、TTGAGGGGACTTTCCCAGGC3′(双链)共孵育1h.灌制20g/LSDSPAGE凝胶，分别加入上述混合物，在溴酚蓝指示下150V电泳.电泳完成后，应用同样大小的滤纸贴附在凝胶上，小心剥离凝胶，将滤纸和凝胶一同干燥，让滤纸完全干在滤纸上，把滤纸和X光片一起置于-70℃下12h以获得放射性自显影影像.1.2.8凋亡细胞比例的测定收集未转染、转染nNOSα和nNOSβ基因的PC12细胞，700ml/L的乙醇固定后，加入PI染料孵育，PBS洗净后，在流式细胞仪下根据荧光强度检测不同DNA含量的

8、细胞数量［8-9］，分析三种细胞凋亡细胞的比例.统计学分析：所有实验均重复3次，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，结果采用SPSS11.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析（OneJ,2001,357:593-615.［2］ChristophersonKS,HillierBJ,Lim,Lai,ShanyS,TobvinD,etal.VitaminDdecreasesNFkappaBactivitybyincreasingIkappaBalph